至 6. 8,再稀释至1L。
[0164] 实施例中对得到的各种甲某杆菌属菌种摇瓶发酵的方法如下:
[0165] 从平板上挑取菌株，分别接种至装有5mL含有l%(v/v)甲醇以及相应浓度抗生素 的CH0I培养基的50mL三角瓶中，在30°C、170rpm下培养3天，制得种子液。
[0166] 测量种子液光密度，保证接种量与接种lmL0D_=0. 8种子液总的0D6(I(I相同，即接 种量=0? 8XlmL/0D6。。。
[0167] 将种子液接种到装有lOOmL含有1% (v/v)甲醇、10 ii g/mL四环素的CHOI培养 基的500mL锥形瓶，30°C摇床中连续培养120小时，菌株生长到达平台期，取样分析，并在 lOOOOrpm下离心10min，保存上清用于后续测量甲羟戊酸含量和甲醇含量。
[0168] 下面对本文的实施例中使用的测定方法和实验方法进行说明。
[0169] 甲羟戊酸含量的测定
[0170] 利用气相色谱测定甲羟戊酸的含量。甲羟戊酸在pH=2,45°C的条件下会内酯化 形成甲羟戊酸内酯，用乙酸乙酯将甲羟戊酸内酯从水相中萃取出来，以藜芦醛为内标物，用 AgilentDB-Wax毛细柱在气相色谱中分析，确定萃取相中甲羟戊酸内酯的浓度。用甲羟戊 酸内酯标准品配制甲羟戊酸标准水溶液，然后经过萃取、分析，可以绘制甲羟戊酸内酯在水 相浓度相对应萃取相浓度的标准曲线。通过标准曲线计算得到水相样品当中的甲羟戊酸内 酯的浓度。
[0171] 气相色谱分析参数如下：
[0172] 柱箱温度：200°C
[0173]进样 口温度：23(TC
[0174] FID检测器温度：260°C
[0175] 载气类型：He
[0176] 载气线速度：50cm/s
[0177]进样量：liiL
[0178] 分流比50
[0179] H2:空气：He=40:400:30
[0180] 假定甲羟戊酸内酯的校正因子是1，可计算得到萃取相中甲羟戊酸内酯的浓度 ：
【主权项】
1. 一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌，其中所述细菌属于甲基杆菌属 (Methylobacterium)，并且所述细菌经过修饰表达HMG-CoA合成酶（HMGS)和HMG-CoA还原 酶（HMGR)。
2. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌经进一步修饰该细菌的乙酰乙酰CoA硫 解酶（phaA酶）的活性得到增强。
3. 根据权利要求1或2所述的细菌，其中所述细菌中的phaC基因被敲除。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有丝氨酸循环途径。
5. 根据权利要求1~4中任一项所述的细菌，其中所述细菌选自扭脱甲基 杆菌（Methylobacteriumextorquens)或罗得西亚甲基杆菌（Methylobacterium rhodesianum)〇
6. 根据权利要求1~5中任一项所述的细菌，其中所述HMG-CoA合成酶的氨基酸序列 是选自下述（a)~（c)中的任一种： (a) 具有SEQIDNO: 1所示的序列， 或者由在SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的序列； (b) 具有SEQIDNO:2所示的序列， 或者由在SEQIDN0:2所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的序列； (c) 具有SEQIDNO:3所示的序列， 或者由在SEQIDN0:3所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的序列。
7. 根据权利要求1~6中任一项所述的细菌，其中所述HMG-CoA还原酶的氨基酸序列 是选自下述（d)~（f)中的任一种： ⑷具有SEQIDN0:4所示的序列， 或者由在SEQIDN0:4所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的序列； (e) 具有SEQIDNO:5所示的序列， 或者由在SEQIDN0:5所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的序列； (f) 具有SEQIDNO:6所示的序列， 或者由在SEQIDN0:6所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和/ 或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的序列。
8. 根据权利要求2~7中任一项所述的细菌，其中所述乙酰乙酰CoA硫解酶的氨基酸 序列为SEQIDNO:7所示的序列； 或者为由在SEQIDN0:7所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和 /或添加而得到的氨基酸序列组成，并且具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的 序列； 或者由与SEQIDNO: 7所示的序列具有75% -致性的氨基酸序列组成，并且具有将乙 酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的序列。
9. 根据权利要求3~7中任一项所述的细菌，其中，所述phaC基因的DNA序列为SEQ IDNo:8所示的序列； 或者为由在SEQIDN0:8所述的氨基酸序列中发生1个或数个氨基酸的缺失、取代和 /或添加而得到的氨基酸序列组成，并且敲出该序列阻断了PHB途径。
10. 根据权利要求1~9中任一项所述的细菌，其中编码所述HMG-CoA合成酶的DNA序 列选自下述（a)~（f)中的任一种： (a) SEQIDNo:9 所示的DNA序列， 或者在SEQIDN0:9所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质， (b) SEQIDNo: 17 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 17所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质， (c)SEQIDNo: 10 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 10所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质， (d) SEQIDNo: 18 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 18所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质， (e) SEQIDNo: 11 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 11所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质， (f) SEQIDNo: 19 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 19所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二 酸单酰辅酶A的活性的蛋白质。
11. 根据权利要求1~10中任一项所述的细菌，其中编码所述HMG-CoA还原酶的DNA 序列选自下述（a)~（f)中的任一种： (a)SEQIDNo: 12 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 12所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质， (b) SEQIDNo: 20 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 20所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质， (c) SEQIDNo: 13 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 13所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质， (d) SEQIDNo: 21 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 21所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质， (e) SEQIDNo: 14 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 14所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质， (f) SEQIDNo: 22 所示的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 22所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A转化为甲 羟戊酸的活性的蛋白质。
12. 根据权利要求2~11中任一项所述的细菌，其中编码所述乙酰乙酰CoA硫解酶的 DNA序列是选自下述（a)~（b)中的任一种： (a) SEQIDNO: 15 所述的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 15所述的DNA序列中发生1个或数个DNA的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的 蛋白质； 或者能够与SEQIDNO: 15所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂交的DNA序列，且该DNA编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白质； (b) SEQIDNO: 16 所述的DNA序列， 或者在SEQIDNO: 16所述的碱基序列中发生1个或数个碱基的缺失、取代和/或添加 而得到的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的 蛋白质； 或者能够与具有SEQIDNO: 16所述的DNA序列或其互补序列的DNA在严格条件下杂 交的DNA序列，且该DNA序列编码具有将乙酰辅酶A转变为乙酰乙酰辅酶A的活性的蛋白 质。
13. -种编码乙酰乙酰CoA硫解酶的DNA序列，其序列为SEQIDNO: 16。
14. 一种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列，其序列为SEQ ID NO: 17。
15. -种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列，其序列为SEQ ID NO: 18。
16. -种编码HMG-CoA合成酶的DNA序列，其序列为SEQ ID No: 19。
17. -种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列，其序列为SEQ ID No:20。
18. -种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列，其序列为SEQ ID No:21。
19. 一种编码HMG-CoA还原酶的DNA序列，其序列为SEQ ID No:22。
20. 生产甲羟戊酸的方法，其包括： 以甲醇为碳源培养权利要求1~12中任一项所述的细菌，生产甲羟戊酸。
【专利摘要】本文涉及一种甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法。具体来说涉及一种用于以甲醇为原料生产甲羟戊酸的细菌，其中所述细菌属于甲基杆菌属(Methylobacterium)，并且所述细菌经过修饰以表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)。本文还涉及利用该表达HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)的甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌来生产甲羟戊酸的方法。
【IPC分类】C12N15-53, C12N15-54, C12R1-01, C12N1-21, C12P7-42, C12N15-60
【公开号】CN104762242
【申请号】CN201410001181
【发明人】张翀, 朱文亮, 邢新会, 梁伟凡
【申请人】清华大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月2日