清反应，猪2型链球 菌SspA蛋白的表达成功。
[0015] 本发明还公开了 一种以上所述重组大肠杆菌BL21/ pET28a-SspA分泌的猪2型链球菌抗原枯草菌素样丝氨酸蛋白酶SspA在构建检测猪2型链 球菌抗体的ELISA方法中的应用。
[0016] 本发明还公开了一种以上所述能够分泌猪2型链球菌抗原枯草菌素样丝氨酸蛋 白酶SspA的重组大肠杆菌fccAericAia co/i BL21/pET28a-SspA在检测猪链球菌2型枯 草菌素样丝氨酸蛋白酶抗体的中应用。
[0017] 本发明的目的是在于提供一种能检测猪2型链球菌血清抗体的ELISA方法，该方 法的特点是采用了猪2型链球菌SspA蛋白作为抗原，所述的SspA蛋白在猪链球菌感染血 清中能检测出抗体，但猪2型链球菌免疫血清中检测不到抗体，使得试剂盒具有可以鉴别 区分感染与免疫动物的特性。
[0018] 为使本发明技术方案公开完全，本发明构建的检测猪2型链球菌抗体的ELISA方 法为： 猪2型链球菌细胞壁蛋白SspA蛋白ELISA检测方法的建立，它包括以下步骤： 猪2型链球菌细胞壁蛋白SspA蛋白ELISA检测方法，所述方法是用的抗原为重组蛋 白SspA，该SspA蛋白抗原是通过设计^5^基因引物对猪2型链球菌基因组进行PCR扩增， 对PCR扩增得到的基因片段克隆至表达载体，转化至大肠杆菌，再诱导表达纯化所获得； 猪2型链球菌细胞壁蛋白SspA蛋白ELISA检测试剂盒的建立，它包括以下步骤： 1)将脱脂奶粉溶于稀释液A中，使其脱脂奶粉的终浓度为5 %，作为待检血清和对照 血清的稀释液。
[0019] 2)取抗原包被板(包被有猪链球菌2型细胞壁蛋白SspA抗原的检测板)，先用 稀释好的洗涤液洗板2次，再将稀释好的待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清各取 100 yL加入到抗原包被板孔中。待检血清设1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔。轻轻振 匀孔中样品（勿溢出），置于37°C温育30分钟。
[0020] 3)弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200 yl，静置3分钟后，弃去孔中 的洗液，并在吸水纸上拍干，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。
[0021] 4)每孔加羊抗猪酶标二抗100yl，置37°C温育30分钟后洗板5次（方法同步骤 3) 〇
[0022] 5)每孔加显色液A、显色液B各一滴（约50 y 1)，混勾，室温（18-25°C，以下相同） 避光显色10分钟。每孔加终止液一滴（约50 y 1)，10分钟内用酶标仪测定每孔0D62(I读值。
[0023] 本发明试剂盒判定标准为：在酶标仪上测各孔0D62(lnm值，通过计算样本S/P值判 定阴阳性，如样本S/P彡0.249时判为阳性，S/P < 0.184时判为阴性，S/P处于两者之间 判为可疑。其中S/P=(样品0D62(I-标准阴性血清0D 62(I)/ (标准阳性血清0D62(I -标准阴 性血清0D62Q )。
[0024] 本发明的具体原理是：SspA蛋白是前期利用体内诱导抗原技术筛选的蛋白，通过 设计基激内部片段（ 328 - 3228bp)的引物，克隆表达了 SspA蛋白，通过 western-blotting分析，目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到了表达的重组蛋白被感染血清 中的抗体所识别，具有良好的免疫活性，但在免疫血清中不含该重组蛋白的抗体，提示了具 备区分猪链球菌感染与免疫的潜力。通过利用表达获得的SspA蛋白，建立间接ELISA方法 确证了 SspA蛋白能作为诊断猪2型链球菌的抗原。其次，提供了一种猪链球菌2型SspA 蛋白的酶联免疫试剂盒在检测猪链球菌2型SspA蛋白的酶联免疫中的应用，将提取的猪链 球菌2型SspA蛋白作为抗原包被于聚苯乙烯微孔板上，然后加待检血清孵育，再加羊抗猪 酶标抗体，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的羊抗猪酶标抗体 就会继续与阳性血清中的抗体反应，酶标仪检测数值就会越高。如果是待检血清阴性，那么 羊抗猪酶标抗体就不会与ELISA板上猪链球菌2型SspA蛋白反应，得到的数值就会低。该 试剂盒特异性好、敏感性高。目前国内还无同类商业化的产品，有着良好的应用前景。
[0025] 本发明的有益效果是： 本发明提供的基于SspA蛋白酶检测猪2型链球菌的检测方法对仪器要求为酶标仪、检 测过程耗时3个小时左右，该方法有很好的敏感性和特异性，能大通量的检测猪血清中的 猪链球菌2型SspA蛋白的抗体，检测不需依赖荧光定量PCR仪、成像仪等，检测所用抗原可 以通过基因工程菌大量培养获得，检测成本低。
【附图说明】
[0026] 图1:本发明使用的抗原基因序列的登录号及其在链球菌05ZYH33中所处的位置 (括号内显示为由下划线的为所述的$5^基因序列在Genbank的登录号，其后的冒号后的 数字为该登录号所示基因序列在链球菌05ZYH33基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜 体字为所述的链球菌的菌株号)。
[0027]图2:是本发明使用的pET_28a(+)载体图谱。
[0028] 图3 :sspA基因的PCR扩增示意图，其中，M为Marker2000，l为空白对照，2为 SspA(328-3228bp)基因。
[0029] 图4:重组质粒pET28a/SspA的双酶切鉴定示意图，其中，M为Markerl5,000，l为 空白对照，2为SspA- pET28a双酶切鉴定。
[0030] 图5 :SspA蛋白的SDS-PAGE分析示意图，其中：M为Protein Marker，1为阴性对 照即空载体未诱导，2为诱导3h后的产物，3为诱导4h后的产物，4为纯化的重组蛋白。
[0031]图6 :SspA重组蛋白的Western-blotting不意图。
[0032] 图7 :阳性血清敏感性试验结果示意图。
【具体实施方式】
[0033] 本发明人经过广泛而深入的研宄，从5： 川分离株SC19的基因组中扩增编 码基因基因片段，通过大肠杆菌原核表达系统获得纯度较高的SspA蛋白。为了使本 发明更加容易理解，下面将结合附表进一步阐述本发明的实施例。结合实施例对本发明做 进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。
[0034] 下面为本实施例所用到的材料： 1)菌株和质粒： 本试验所用猪链球菌2型菌株为2005年四川爆发猪链球菌病时的资阳分离株。大肠 杆菌基因工程菌株DH5a和BL21由本试验室保种。载体为pET28a(+)本实验室保存，其图 谱如图2所示。
[0035] 2)主要试剂及缓冲液： 各种限制酶及T4 DNA连接酶、PCR相关试剂、DNA Marker及胶回收试剂盒、限制性内切 酶feoR I，5^1均购自为TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒、溶菌酶、IPTG、蛋白Marker 购自上海生物工程公司；蛋白浓缩离心管购自Millipore公司；细菌基因组DNA提取试剂 盒购自TIANGEN公司；Tris-HCl、0. 3% N-十二烷基肌氨酸钠（SKL)，NC膜、1%的牛血清白 蛋白，GST，卡那霉素，ECL显色液，SDS-PAGE配胶试剂盒购自北京索莱科技有限公司；HRP标 记的二抗，底物液A，底物液B，以及显色液等购自武汉科前动物生物制品有限公司。
[0036] 细菌裂解缓冲液配方：Tris 1.51g、EDTA 0.47g、NaCl 1.46g溶解在水中，调PH 到8. 0,定容至200mL。
[0037] 磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾5. 59g与磷酸二氢钾0.41g，加水溶解成1L,调PH值 为 7. 8-8. 0〇
[0038] 实施例1:猪2型链球菌基因组DNA的提取 将本实验室保藏的猪2型链球菌接种于含有10%灭活新生牛血清的TSA培养基上， 挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，置于摇床150 r/min，37°C震荡培养过夜。取 1. 0 ml菌液于1. 5 ml的离心管中，参照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的