组质粒pRC43的图谱。
[0025] 图5为基因工程菌HK412的发酵结果图；
[0026] 其中，Concentration (g/L)表示浓度（g/L)，Time (h)表示发酵时间（h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。
[0027] 图6为基因工程菌HK422的发酵结果图；
[0028] 其中，Concentration (g/L)表示浓度（g/L)，Time (h)表示发酵时间（h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。
[0029] 图7为基因工程菌HK432的发酵结果图；
[0030] 其中，Concentration (g/L)表示浓度（g/L)，Time (h)表示发酵时间（h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇。
[0031] 图8为基因工程菌的基因表达情况以及发酵结果；
[0032] A 为基因工程菌 IS1-1，IS5-1，IS5-2, IS5-3, IS5-4, IS5-5, IS5-6 的基因表达情 况；
[0033] B 为基因工程菌 IS1-1，IS5-1，IS5-2, IS5-3, IS5-4, IS5-5 的发酵结果图；
[0034] C为工程菌IS5-6的发酵结果图；
[0035] 其中，IS1-1表示以IS1为同源序列，经过一轮整合；IS5-1表示以IS5序列为同源 序列，经过一轮整合，其他依次类推；Concentration (g/L)表示浓度（g/L) 〇
[0036] 图9为基因工程菌IS5-5在5L发酵罐中分批发酵的发酵结果图；
[0037] 其中，Concentration (g/L)表示浓度（g/L)，Time (h)表示发酵时间（h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇，Dry cell weight(g/L)表示发酵液中基因工 程菌细胞干重（g/L)。
[0038] 图10为基因工程菌IS5-5在15L发酵罐中分批补料发酵的发酵结果图；
[0039] 其中，Concentration (g/L)表示浓度（g/L)，Time (h)表示发酵时间（h)，Glucose 为葡糖糖，Xylose为木糖，Xylitol为木糖醇，Dry cell weight(g/L)表示发酵液中基因工 程菌细胞干重（g/L)。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0041] 本发明是在申请号为201410750635. 3、名为"一种基因工程菌及其构建方法和在 生产木糖醇中的应用"发明专利申请的基础上做的进一步研宄。
[0042] 上述发明专利申请中公开了一种能够高效生产木糖醇的含特定木糖还原酶基因 的基因工程菌，该木糖还原酶基因插入到特定表达载体中，以质粒的形式在基因工程菌中 进行表达；如【背景技术】中所述的，以质粒作为表达载体时，容易导致宿主细胞代谢负担过 重、质粒分离稳定性差、蛋白表达不可控，并且为了维持菌株中质粒的稳定存在，还需要添 加抗生素，不仅增加生产成本还带来抗药性的问题。为此，本发明采用基因组整合技术将目 的基因整合至宿主细胞基因组上；但是，采用现有的基因组整合技术只能实现目的基因在 基因组上的单拷贝，严重影响了目的蛋白的表达量，故为解决上述问题，本发明采用特定的 同源序列IS序列，该序列为宿主细胞的正常组成成分且拷贝数多，其存在对细胞的生长没 有特定的功能，只是在细胞遗传时，增加其变异概率，对生物的进化有益，但是对工业生产 却是无益的。
[0043] 下列实施例中，质粒 pET_30a(+)、pTrc99a-rbs_xr6600 和菌株 HK401 以及 XR 基 因均来自申请号为201410750635. 3、名为"一种基因工程菌及其构建方法和在生产木糖醇 中的应用"的发明专利申请文献中，XR基因的氨基酸序列如SEQ IDNo. 1所示；枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis) (DSM 4181)购至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为 (CGMCC 1. 3376)〇
[0044] 实施例1不同启动子基因工程菌的构建
[0045] 1、Trc启动子表达载体的构建
[0046]以质粒pET_30a(+)和pTrc99a-rbs_xr6600为模板，设计引物ori-kan-Pl和 ori-kan-P2扩增pET-30a(+)上的复制子和卡那霉素抗性基因，设计引物Ptac+XR-Pl和 Ptac+XR-P2扩增质粒pTrc99a-rbs-xr6600上的启动子、目的基因及终止子，分别酶切，酶 切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a，挑取 卡纳霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：
[0047]pTrc99a-kan-xr6600，将质粒转入菌株HK401，构建含有相应重组质粒的基因工程 菌，命名为HK412。
[0048] 2、pBAD启动子表达载体的构建
[0049]用Nhel和Hindlll酶切pBAD24去掉多克隆位点及核糖体结合位点（RBS)，用Xbal 和Hindlll酶切pET-30a(+)获得RBS位点及多克隆位点，以T4连接酶连接，构建重组质粒； 并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a，挑取氨苄青霉素平板上长出的菌落，提取质 粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：PBAD24M。
[0050] 用引物XR-P1和XR-P2扩增XR基因，用Ndel和Hindlll分别酶切，酶切后以T4 连接酶连接，构建重组质粒；并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a，挑取氨苄青霉 素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：
[0051] PBAD24M-XR，将质粒转入菌株HK401，构建含有相应重组质粒的基因工程菌，命名 为 HK422。
[0052] 3、P43启动子表达载体的构建
[0053] 用引物P43-P1和P43-P2从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 168中扩增强组 成型启动子P43 ;再用引物P43-XR-P1和P43-XR-P2扩增XR基因，经过重叠PCR将P43启 动子与XR基因连接在一起；用引物pcdf-Pl和pcdf-P2以pCDF-duet质粒为模板，扩增质 粒上的复制子及硫酸链霉素抗性基因，分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒； 并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a，挑取硫酸链霉素平板上长出的菌落，提取质 粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：P⑶F43,将质粒转入菌株HK401，构建含有相 应重组质粒的基因工程菌，命名为HK432。
[0054] 上述表达载体构建过程中采用的引物以及PCR反应体系和反应条件如下：
[0055] (1)引物序列
[0056]ori-kan-Pl ：5, -CGGGGTACCAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC-3'
[0057] 〇ri-kan-P2：5, -AAAACTGCAGCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3'
[0058] Ptac+XR-Pl：5, -GGGGTACCCATATGGTGCACTCTCAGTACAAT
[0059] CTG-3'
[0060] Ptac+XR-P2：5, -AAAACTGCAGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT-3'
[0061] XR-P1：5, -CCGGAATTCATGGTTCCTGCTATCAAGCTCAA-3'
[0062] XR-P2 ：5, -CCCAAGCTTCTAACCGAAAATCCAGAGGTTCTC-3,
[0063] P43-P1 ：5, -CCGGAATTCGAGCTCAGCTTTATTGAGTGGATGA-3,
[0064] P43-P2 :5' -GTTGAGTTTGATCGCAGGTACCATTTGTTTTCCTCCT
[0065] TGTTCCGT-3'
[0066] P43-XR-P1 :5, -ACGGAACAAGGAGGAAAACAAATGGTACCTGCG
[0067] ATCAAACTCAAC-3'
[0068] P43-XR-P2：5, -CCCAAGCTTCTAACCGAAAATCCAGAGGTTCTC-3,
[0069] pcdf-Pl：5, -CCCAAGCTTCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTA
[0070] GCATAACCCCTT-3'
[0071] pcdf-P2：5, -CCGGAATTCGCGGTTCAGTAGAAAAGATCAAAGGA
[0072] TC-3'
[0073] (2)PCR 反应体系：
[0074] 体系总体积为 50 y L，其中 PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25L，上下游引物 (10 yM)各 1. 5L，模板（50ng/ml) 1L，ddH20 21L。
[0075] (3)PCR 反应程序：
[0076] 5°C预变性 2min ;98°C变性 10s，Tm 退火 15s，72°C延伸 5s/kb，30 个循环；72°C延 伸5min，4°C保温。
[0077] 将各基因工程菌经活化后接种于LB(5g I71酵母膏，lOg 蛋白胨，和lOg PNaCl)培养基中，分别在30°C下培养15h，培养完成后离心收集细胞，使用磷酸钾缓冲液 (pH 7. 4)重悬，破胞后离心获得上清液即为粗酶液，采用NADPH在340nm处的吸光度法分别 检测木糖还原酶的酶活。经测定HK412，HK422和HK432的酶活分别为3644. 2U/L，1071. 8U/ L 和 2758. 3U/L。
[0078] 实施例2不同工程菌产木糖醇能力的测试
[0079] 将工程菌HK412、HK422、HK432按2%接种于45mL改