良M9培养基（1L培养基中含 4 ~6g Na2HP04, 2 ~5g KH2P04,1 ~2g NH4C1，1 ~5g NaCl，1 ~5mM MgS04,1 ~5mMCaCl2， 2~lOg/L酵母膏）中，于30°C下培养至0D600为0. 6~1时，添加适量诱导剂（Trc :IPTG pBAD :阿拉伯糖）并向发酵液中添加木糖至终浓度为20g/L、添加葡萄糖至终浓度为10g/L， 于30°C培养，考察各工程菌的发酵特性，考察结果如图5、6、7所示。
[0080] 如图5所示，工程菌HK412在0.1 mM IPTG诱导后能在34. 5h内将葡萄糖和木糖消 耗完，产生木糖醇18. 5g/L，生产效率为0. 62g/L/h ;
[0081] 如图6所示，工程菌HK422在0.2%阿拉伯糖的诱导下，在34. 5h内并不能全部利 用完葡萄糖和木糖，产生19. 5g/L木糖醇，生产效率为0. 48g/L/h ;
[0082] 如图7所示，工程菌HK432在不需要诱导剂的情况下，在34. 5h内也能全部利用完 葡萄糖和木糖，木糖醇浓度为19. 79g/L，木糖醇的生产速率最高达0. 7g/L/h。
[0083] 实施例3整合载体的构建
[0084] 用引物CM+R6K-P1和CM+R6K-P2以PKD3为模板扩增R6K复制子和携带FRT位点 的氯霉素抗性基因，用引物IS5-P1和IS5-P2扩增插入序列IS5,通过重叠PCR将IS5序列 与R6K复制子和氯霉素抗性连在一起，设计引物p⑶F43-P1和p⑶F43-P2,以p⑶F43为模板 扩增启动子P43、XR和终止子，分别酶切，酶切后以T4连接酶连接，构建重组质粒；并将重组 质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5 a，挑取硫酸链霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序 后，将验证正确的重组质粒命名为：PRC43。
[0085] 其中，引物的具体序列如下：
[0086] CM+R6K-P1 :5' -AAAACTGCAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA-3'
[0087] CM+R6K-P2：5, -AGTGGGAGAGATCTCACTAAGGTGCCTCACTGATT
[0088] AAGCATTGG-3'
[0089] IS5-P1 :5' -CCGGAATTCAAGAGATTTTCTTGTCCCGCATG-3?
[0090] IS5-P2 ：5, -TGCTTAATCAGTGAGGCACCTTAGTGAGATCTCTCCCA
[0091] CTGACGTAT-3'
[0092] pCDF43-Pl :5' -CCGGAATTCGAGCTCAGCTTTATTGAGT-3'
[0093] pCDF43-P2 :5' AAAACTGCAGTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTA-3'
[0094] 利用构建pRC43相同的方法，构建带有IS1整合序列的质粒，命名为pRC431.引物 序列为：
[0095] IS1-P1 :5' -CCGGAATTCATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAG-3'
[0096] IS1-P2：5? -TGCTTAATCAGTGAGGCACCTTATTGATAGTGTTTTATGTTCAGATAATGCCCGATG AC-3'。
[0097] 实施例4多拷贝整合基因工程菌的构建
[0098] 提取pRC43质粒，以HK401菌株为多拷贝整合宿主，简单的氯化钙法制作感受态， 热击法转化，涂布，筛选能在氯霉素抗性平板生长的菌落即为质粒整合进基因组的菌株；将 获得的菌株再制作成感受态，导入PCP20质粒，30°C培养至菌液变浑浊，升高温度至42°C过 夜培养，借助FRT位点将菌体携带的氯霉素抗性基因删除。如此往复，获得不同拷贝数的菌 株IS5-1，IS5-2, IS5-3, IS5-4, IS5-5, IS5-6。为了验证其它IS序列同样可以作为整合位 点，用同样的方法用PRC431进行整合，获得IS1-1。
[0099] 整合菌株拷贝数的确定：
[0100] 将各菌株接种于LB培养基中，培养6h后收取菌体，利用TRIzol试剂提取总mRNA， 利用反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，以此为模板利用One Step SYBR?PrimeScript? RT-PCR Kitll荧光定量PCR试剂盒使用Bio-Rad CFX96Real-Time PCR检测系统扩增目的 基因，以16sRNA为内参基因，使用FX Manager软件计算出菌株目的基因的表达情况，间接 算出基因的拷贝数。
[0101] 荧光定量PCR引物如下：
[0102] QPCR-F ：GACGGCAAGAGCGAGAT ；
[0103] QPCR-R : TGCTGGACGAGGTAGGG
[0104] 16sRNA-F ：ACCCTTATCCTTTGTTGCC ；
[0105]16sRNA-R ：TATGAGGTCCGCTTGCTCT ；
[0106] 由于利用大肠杆菌自身的重组系统进行基因组整合，其重组效率相对较低，每一 轮整合，也基本都是增加一个拷贝，通过定量PCR的结果可以看出此结果（图8A)。
[0107] 通过上述实施例2中所述的相同方法考察不同拷贝数的菌株生产木糖的能力，从 图8B，8C可以看出，随着拷贝数的增加木糖醇的产量逐渐增加，当拷贝达到6个时，其生产 效率相比较5个拷贝时，并没有显著增加，当拷贝数达到5个时，其转化效率已与使用质粒 的水平相当这说明在使用质粒时，虽然酶活较高，但这并不是木糖醇生产效率的决定因素， 反而在发酵过程中造成酶的浪费及宿主菌过重的代谢负担，所以选择5个拷贝作为最终菌 种。
[0108] 另外，通过IS1作为同源序列的整合也能达到IS5同样的效果，说明IS序列作为 同原序列进行整合是一种简便有效的基因组整合方法。
[0109] 实施例5利用工程菌IS5-5生产木糖醇的应用实例
[0110] 1、重组工程菌分批发酵
[0111] (1)将工程菌IS5-5按2%接种过夜的种子培养基中，于30°C下培养8h，获得种子 液；
[0112] 种子培养基及发酵培养基的配方为：1L培养基中，含4~6g Na2HP04,2~5g KH2P04，1 ~2g NH4C1，1 ~5g NaCl，l ~5mMMgS04，l ~5mM CaCl2，10 ~20g/L 蛋白胨，2 ~ 8g/L的酵母膏。
[0113] (2)将种子液按10%接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，于30°C下培养至 OD_为5~15(约4h)时，向发酵液中添加木糖至终浓度为100g/L、添加葡萄糖至终浓度 为50g/L，于30°C培养，定点采集样品测定各种糖及木糖醇的含量。
[0114] 分析条件：Dionex UltiMate 3000 高效液相系统，Corona Charged Aerosol 检测 器，Aminex HPX-87C(7.8mmX300mm)糖柱，流动相为纯水（0.8mL min'TGC)。
[0115] 考察工程菌IS5-5发酵液中的发酵特性，见图9。
[0116] 由图9可见，工程菌IS5-5能快速的转化木糖生产木糖醇，发酵液中，木糖醇最终 浓度能达到123. 2g//L，生产效率为1. 81g/L/h。
[0117] 2、重组工程菌分批补料发酵
[0118] 步骤（1)_(2)同本实施例第1部分"工程菌分批发酵"（发酵在15L发酵罐中进 行），在发酵进行到40h时另外补加木糖和葡萄糖至终浓度分别为80g/L和40g/L，考察工 程菌IS5-5的发酵特性，见图10。
[0119] 由图10可见，经过100小时的发酵，工程菌IS5-5能将所有糖耗完，发酵液中木糖 醇最终浓度达到180. 74g/L。
【主权项】
1. 一种大肠杆菌基因组的整合载体，包括复制子、表达原件、目的基因、抗性基因和整 合位点，其特征在于，所述的整合位点为IS序列。
2. 如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的IS序列为IS5序列。
3. 如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的抗性基因为带有FRT位点的抗性 基因。
4. 如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，所述的复制子为R6K。
5. 如权利要求1所述的整合载体，其特征在于，碱基序列如SEQIDNo. 2所示。
6. -种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌基因组的整合载体，其特征在于，所 述的整合载体如权利要求1~5任一项所述。
7. 如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌基因组中，所述整合载体存 在若干拷贝。
8. 如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述目的基因为木糖还原酶基因，碱 基序列如SEQIDNo. 1所不。
9. 如权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，目的基因上游的启动子为组成型启 动子P43。
10. 如权利要求7~9所述的基因工程菌在生产木糖醇中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用，该大肠杆菌基因组整合载体，包括复制子、表达原件、目的基因、抗性基因和整合位点，所述的整合位点为IS序列；该基因工程菌包括大肠杆菌和整合进大肠杆菌基因组的上述整合载体。本发明以大肠杆菌基因组中的拷贝数较多的IS序列作为整合位点，进行载体与基因组的整合，不仅整合方法简单，而且整合到基因组上的目的基因遗传稳定，既解决了质粒作为表达载体时，工程菌代谢负担重、分离不稳定和蛋白表达不可控的问题，又简化了现有的整合技术，解决了现有整合技术多拷贝整合繁琐、耗时等问题。
【IPC分类】C12N15-70, C12N1-21, C12P7-18
【公开号】CN104789586
【申请号】CN201510196843
【发明人】吴绵斌, 苏卜利, 林建平, 杨立荣
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月23日