+1)， C27H29FN4OS(476. 20)〇
[0102]
[0103] 操作同上，所不同的是使用3-氰基溴苄。
[0104] 产物为白色固体，收率：63. 1%，熔点99-102°C
[0105] 屮匪1?(4001取，〇0(：13-(16，口口111)8:7.72((1，111，了 = 5.4取，（：6-认1611〇口71^1111 dine-H)，7. 64(s，1H，C2-Ph' -H)，7. 58 (t，2H，J=9. 0Hz，C4-Ph' -H)，7. 44 (t，1H，J= 7. 7Hz，C5-Ph' -H)，7. 17 (d，1H，J=5. 3Hz，C7-thienopyrimidine-H)，6. 90(s，2H，C3,C5-Ph"_ H)，5. 14(s，1H，NH)，3. 51(s，2H，N-CH2)，2. 72-2. 75 (m，2H)，2. 32(s，3H，C4-Ph"-CH3)，2. 09(s， 9H)，2. 93(s，2H)，I. 42-1. 50 (m，2H) ?ESI-MS:m/z484. 6 (M+l)，506. 5 (M+Na)，C28H29N5OS(483. 21) 〇
[0106]
[0107] 操作同上，所不同的是使用4-氯甲基吡啶盐酸盐。
[0108] 产物为白色固体，收率：50. 7%，熔点135-137°C
[0109] 4匪1?(4001泡，〇0(：13-(16，口口111)8:8.54((1，211，了 = 5.91^，(：2，(：6-口71^(11脱-11) ,7. 71(d, 1H,J= 5. 4Hz,C6-thienopyrimidine-H), 7. 28 (d, 2H,J= 6. 6Hz,C3,C5-pyrid ine-H), 7. 18 (d, 1H,J= 5. 4Hz,C7-thienopyrimidine-H), 6. 90 (s, 2H,C3,C5-Ph-H), 4. 86 (s, 1H,NH)，3. 50 (s, 2H,N-CH2)，2. 74-2. 77 (m, 2H)，2. 32 (s, 3H,C4-Ph" -CH3)，I. 95-2. 09 (m，11H),I. 44-1. 52(m，2H).ESI-MS:m/z460. 6(M+1)，482. 6(M+Na),C26H29N50S(459. 21)。
[0110]
[0111] 操作同上，所不同的是使用2, 4-二氟溴苄。
[0112] 产物为白色固体，收率：59.6%，熔点110-112°〇.
[0113] 1HNMR(400MHz，CDCl3-d6,ppm)S: 7. 70 (d，1H，J= 5. 4Hz，C6-thienopyrimidine-H) ，7. 36 (dd，1H，J1= 15. 1Hz，J2= 8. 3HzC5-Ph' -H)，7. 17 (d，1H，J= 5. 3Hz，C7-thienopyrim idine-H)，6. 90 (s，2H，C3,C5-Ph''-H)，6. 75-6. 85 (m，2H)，4. 89 (d，1H，J= 7. 3Hz，NH)，3. 52(s ，2H，N-CH2)，2. 75-2. 78 (m，2H)，2. 32 (s，3H，C4-Ph"-CH3)，2. 09-2. 17 (m，9H)，I. 93-1. 95 (m，2H )，I. 39-1. 47 (m，2H).ESI-MS:m/z495. 5 (M+l)，517. 6 (M+Na),C27H28F2N4OS(494. 20)。
[0114] 实施例4 :目标化合物的体外抗HIV活性测试
[0115] 测试原理
[0116] 化合物体外抗HIV活性筛选采用MTT法。MTT全称为溴化-3-(4, 5-二甲基-2-噻 唑基）-2, 5-二苯基四唑氮（商品名：噻唑蓝），可用于检测细胞的存活和生长。检测原理 为：MTT可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细 胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm 下的吸光度（A)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。
[0117] 由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内（5-7天）会发生病变，因此向HIV感染 的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间（5-7天）的培养 后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50 %细胞免于细胞病变的药物浓度（EC5tl) 即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50%未感染HIV的细胞发生 病变的浓度（CC5tl),计算出选择系数（selectivityindex，SI=CC5(i/EC5。）。
[0118] 测试材料和方法
[0119] (I)HIV-I(IIIb)、HIV-2 (ROD)毒株、各种HIV-I耐药株：由比利时鲁汶大学医学院 Rega研宄所提供。
[0120] (2)MT-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院Rega研宄院提供。
[0121] (3)MTT:购自美国Sigma公司。
[0122] (4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5 个稀释度。
[0123] (5)阳性对照药：奈韦拉平（NVP)、依法韦仑（EFV)、依曲韦林（TMC125)、齐多夫定 (AZT) 〇
[0124] (6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后 用MTT比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度（A)值，计算出EC5(I，CC5tl 以及SI。
[0125] (7)MTT比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入MTT溶液（5mg/ ML) 20yL，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150yLDMS0,充分混合，用酶标 仪中测定590nm下的吸光度（A)值。
[0126] 实验方法
[0127] 在96孔细胞培养板上，加入50yL含IX104MT-4细胞培养液，再分别加入20yL 感染HIV-I(IIIb或者RES056)或HIV-2 (ROD)的MT-4细胞混悬液（每毫升含100倍 CCID5tl)或者空白培养基（毒性测定），然后加入不同浓度的待测化合物溶液或者阳性对照 药物，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5%CO2氛围，37°C下培养5天，向每个孔中加 入20yL(5mg/mL)MTT溶液，继续培养2小时，然后加入DMS0,使用酶标仪测定反应溶液在 540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率P%。同时设空白和药物对照组 和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50%的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需浓度 (EC5tl)。选择指数的计算：SI=CC5(i/EC50。
[0128] 按照上述实验方法对合成的部分噻吩并嘧啶类衍生物进行了细胞水平的抗 HIV-I(IIIb)，单突变株K103N、Y181C、Y188L以及双突变株RES056 (K103N/Y181C)的活性筛 选，活性结果如表1所示。
[0129] 表1部分IA系列化合物和参考药物的结构及其抗HIV-I活性（MT-4细胞）
[0134] 注：$(：5(|:保护50%感染111￥-1的阶-4细胞免于细胞病变的化合物浓度洫代表化 合物EC5(l〈10nM，B代表化合物EC5tl值为 10-lOOnM，C代表化合物EC5(l>100nM;NVP、EFV、ETV、 AZT分别代表上市药物奈韦拉平、依法韦伦、依曲韦林和齐多夫定。
[0135] 表2部分IA系列化合物及参考药物的细胞毒性及选择指数（MT-4细胞）
[0136]
[0137] 注：30：5(|:使得50%的奶'1'细胞发生病变时的药物浓度洫代表化合物51>10000， B代表化合物SI值为1000-10000,C代表化合物SK1000 ;X1 :SI彡1或者〈1 ;NVP、EFV、 ETV、AZT分别代表上市药物奈韦拉平、依法韦伦、依曲韦林和齐多夫定。
【主权项】
1. 一种唾吩并喀晚类衍生物，或其药学上可接受的盐、醋或前药，其特征在于，具有通 式I所示的结构：其中，虚线代表A与B之间为双键、B与D之间为双键、A与B之间为单键或者B与D之 间为单键之中的一种； A为；S或者C扣）； B为；S或者C(V); D为；S或者C(W); 并且A，B和D有且只有一个为S; 其中U，V和W各自独立的为化面素，Ci-Ce烷基，Ci-Ce烷氧基，C2_Ce締基，Cs-Ce环烧 基，0Cs-Ce环烷基，苯基，苄基，=氣甲基，氨基，哲基，各种取代的六元杂环、各种取代的五 元杂环； Z为；F，F2, 0H，COOH，0)畑2,COOC2H5; X为；0，NH或者S之中的一种； Ri，R2, Rs各自独立的为化面素，氯基，Ci-Ce烷基，Ci-Ce烷氧基，締基，立氣甲基， 氨基，哲基氯基己締基； Ar为：取代苯环、取代蒙环、各种取代的六元杂环、各种取代的五元杂环、各种取代的 六元并五元杂环、各种取代的六元并六元杂环、各种取代的五元并五元杂环、各种取代的苯 并五元杂环或各种取代的苯并六元杂环。2. 权利要求1所述的化合物，其特征在于，通式I中的Ar为具有通式（a)或者通式化） 的取代苯环：其中，R4为H，CH3,COCH3,COOCH3,COOC2H日，COOH，SO2CH3或SO2CF3;R日为C1，化，Me,NHCH3， 畑COCH3,N服〇2邸3或畑SO2CF3。3. 权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，结构式为下列之一：其中，R，U，V，W，Z和Ar同上通式I所述。4.权利要求3所述的化合物，其特征在于，为如下具体化合物之一：o5.权利要求1所述的化合物的制备方法，步骤如下；W2, 4-二氯取代的唾吩并喀晚1 为初始原料，首先在N，N-二甲基甲酯胺溶液中与取代苯酪、苯硫醇或苯胺发生亲核取代生 成中间体2 ;然后中间体2在二甲基亚讽中与N-Boc-4-氨基嗽晚反应并随后在S氣己酸条 件下脱Boc基团保护生成关键中间体4 ;或者中间体2发生布赫瓦尔德-哈特维希偶联反应 生成中间体3然后脱B0C保护得到中间体4 ;最后此关键中间体4在N，N-二甲基甲酯胺溶 液中和碳酸钟做碱的条件下，与各种取代氯节或漠节反应生成目标产物；合成路线如下：试剂及条件：（i)取代苯酪、苯胺或者苯基硫醇，二甲基甲酯胺，碳酸钟，室温；（ii)N-Boc-4-氨基嗽晚，二甲基亚讽，碳酸钟，120°C; (iii)N-Boc-4-氨基嗽晚，醋酸钮，4, 5-双 (二苯基麟）-9, 9-二甲基氧杂慈，碳酸飽，90°C，二氧六环；（iv)二氯甲烧，S氣己酸，室温； (V)取代氯节或漠节，二甲基甲酯胺，碳酸钟，室温。6. -种如权利要求1-4任一项所述化合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒药物中 的应用。7. -种药物组合物，包含权利要求1-4任一项所述化合物和一种或多种药学上可接受 载体或赋形剂。
【专利摘要】本发明公开了一种噻吩并嘧啶类衍生物及其制备方法和应用，噻吩并嘧啶类衍生物是具有通式Ⅰ所示结构的化合物及其药学上可接受的盐、酯或前药，本发明还提供了化合物的制备方法，以及含有一个或多个此类化合物的组合物在制备治疗和预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。
【IPC分类】A61P31/18, A61K31/519, C07D495/04
【公开号】CN104926829
【申请号】CN201510309662
【发明人】刘新泳, 康东伟, 展鹏, 方增军, 李震宇
【申请人】山东大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月8日