核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002]近年来，因基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗受到关注。另外，在农业和畜牧业领域，也开发出较多将基因用于品种辨别、品种改进的方法。作为用于利用基因的技术，PCR(Polymerase Chain React1n ;聚合酶链反应)等技术广泛普及。时至今日，PCR成为在生物体物质的信息解析中必不可缺的技术。PCR是通过对含有作为扩增的对象的核酸(目标核酸)以及试剂的溶液实施热循环使目标核酸扩增的方法。作为PCR的热循环，一般为以两阶段或者三阶段的温度实施热循环的方法。
[0003]另一方面，对于以医疗现场中的流感为代表的感染症的诊断，在现状中主流方式是使用过敏源检测试纸(immunochromato)等简易检查套件。但是，在这种简易检查中，存在精度不够的情况，希望在感染症的诊断中应用能够获得更高检查精度的PCR。另外，在医疗机构中的一般门诊等中，由于诊察的时间受限的关系，能够花费在检查上的时间被限制为短时间。因此，例如，对于流感的检查，现状是牺牲了检查的精度而通过简易的过敏源检测试纸等检查将时间缩短来进行。
[0004]根据这种情况，为了实现在医疗现场通过能够获得更高精度的PCR进行检查，需要缩短反应所需要的时间。作为用于在短时间内进行PCR的反应的装置，例如在专利文献I中公开了如下生物体试料反应装置，即，通过使填充有反应液、以及不与反应液混和并且比反应液比重小的液体的生物体试料反应用贴片绕水平方向的旋转轴旋转，使反应液移动从而实施热循环(专利文献I)。另外，作为PCR的一个方法公开有:使用磁性粒子的方法(专利文献2)、将磁性粒子作为液滴的移动机构来使用并且使基板上的在温度变化区域中的液滴移动从而进行PCR的热循环的方法(专利文献3)等。
[0005]专利文献1:日本特开2009 - 136250号公报
[0006]专利文献2:日本特开2009 - 207459号公报
[0007]专利文献3:日本特开2008 - 012490号公报
【发明内容】
[0008]在使用磁性粒子的核酸提取方法中，在使核酸从磁性粒子表面向溶液(溶出液)脱离时，若将溶出液加热则溶出效率提高。本发明的目的在于提供能够以稳定的温度将溶出液加热的核酸扩增反应装置。
[0009]本发明的核酸扩增反应装置具备:旋转体，其能够安装盒，上述盒具备:管，在该管的内部依次具备由油构成的第一液柱、由与油相分离并且对结合有核酸的磁性粒子进行清洗的第一清洗液构成的第二液柱、由油构成的第三液柱、由与油相分离并且从结合有上述核酸的磁性粒子溶出上述核酸的溶出液构成的第四液柱以及由油构成的第五液柱；以及核酸扩增反应容器，其与上述管的配置有上述第五液柱的一侧连通，并且使核酸扩增反应试剂保持在油中；以及第一加热器，其能够对上述管的与上述核酸扩增反应容器连通的一侧的端部、与上述核酸扩增反应容器的与上述管连通的一侧的端部即第一区域进行加热，通过上述旋转体旋转使上述盒的姿势变化，从而含有从上述管导入的上述溶出液的液滴在上述核酸扩增反应容器的内部移动。也可以具备第二加热器，该第二加热器能够对上述核酸扩增反应容器的其他端部即第二区域进行加热。也可以具备以下述方式控制上述第一加热器的温度的控制部，在上述核酸溶出时将上述第一加热器的温度设为第一温度，在上述核酸溶出以后，并且在上述旋转体旋转使上述盒的姿势变化从而含有从上述管导入上述核酸扩增反应容器的内部的上述溶出液的液滴向上述第二区域移动以前，上述第一加热器的温度成为比上述第一温度高的第二温度。
[0010]本发明的核酸扩增方法是使用本发明的核酸扩增反应装置对核酸进行扩增的方法，包括:在由上述溶出液构成的第四液柱中从结合有上述核酸的磁性粒子溶出上述核酸的溶出工序；在上述溶出工序之后使磁性粒子从上述第四液柱向上述第一液柱的方向退避的磁性粒子退避工序；以及在上述磁性粒子退避工序之后从上述管向上述核酸扩增反应容器压出上述溶出液的液滴形成处理工序，在上述溶出工序中，将上述第一加热器的温度设为第一温度，在上述溶出工序之后，通过上述旋转体的旋转使上述盒的姿势变化，在上述核酸扩增反应容器内部的含有上述溶出液的液滴从上述第一区域向上述第二区域移动以前，以上述第一加热器的温度成为上述第二温度的方式，将上述第一加热器的温度变更为上述第二温度。也可以在进行上述磁性粒子退避工序或者液滴形成处理工序期间，使上述第一加热器从上述第一温度上升至上述第二温度。也可以为上述核酸是RNA，上述溶出液具备逆转录反应试剂，并且具备将上述RNA在上述溶出液中进行逆转录的逆转录工序。也可以在进行上述磁性粒子退避工序、液滴形成处理工序或者逆转录工序期间，使上述第一加热器从上述第一温度上升至上述第二温度。
【附图说明】
[0011]图1A以及图1B是盒I的说明图。
[0012]图2A?图2C是盒I的动作说明图。
[0013]图3A?图3D是罐3的说明图。
[0014]图4是固定爪25以及引导板26与安装部62的说明图。
[0015]图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0016]图6A是PCR装置50的内部结构的立体图。
[0017]图6B是PCR装置50的主要结构的侧视图。
[0018]图7是PCR装置50的框图。
[0019]图8A是旋转体61的说明图。
[0020]图8B是盒I安装于旋转体61的安装部62的状态的说明图。
[0021]图9A?图9D是安装盒I时的PCR装置50的状态的说明图。
[0022]图10是使磁铁71向下方移动时的磁性粒子7的动态的概念图。
[0023]图1lA?图1lC是核酸溶出处理的说明图。
[0024]图12是使磁铁71摆动时的磁性粒子7的动态的概念图。
[0025]图13是表示磁铁71有无摆动的表。
[0026]图14A?图14C是液滴形成处理的说明图。
[0027]图15A?图15D是热循环处理的说明图。
[0028]图16A以及图16B是第二实施方式的盒I的说明图。
[0029]图17A是第二实施方式的盒I的初始状态的说明图。
[0030]图17B是从图17A的状态按压柱塞10从而密封件12A与下注射器22接触时的侧视图。
[0031]图17C是按压柱塞10以后的第二实施方式的盒I的说明图。
[0032]图18A以及图18B是第二实施方式的PCR容器30的周边的说明图。
【具体实施方式】
[0033]以下，对本发明的实施方式详细地进行说明。此外，本领域普通技术人员通过本说明书的记载能够理解本发明的目的、特征、优点及其构思，本领域普通技术人员能够根据本说明书的记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式是表示本发明的优选实施方式的例子，是为了例示或者说明而示出的，并不是将本发明限定为这些实施方式。在本说明书所公开的本发明的意图以及范围内，能够基于本说明书的记载进行各种改变以及修饰，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0034]第一实施方式
[0035]首先，对安装于PCR装置50 (核酸扩增反应装置)的盒进行说明，然后对本实施方式的PCR装置50的结构、动作进行说明。
[0036]盒I
[0037]图1A以及图1B是盒I的说明图。图2A?图2C是盒I的动作说明图。图2A是盒I的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10从而密封件12A与下注射器22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10以后的盒I的说明图。
[0038]盒I是进行从结合有核酸的磁性粒子7溶出核酸的核酸溶出处理的容器，并且是对成为PCR溶液的溶出液47进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。
[0039]核酸提取处理在罐3中进行，并且在通过管20期间被精制。虽然管20的材质并不特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。尤其因为若选择透明的玻璃、树脂作为管20的材质则能够从管20的外部观察内部，所以更加优选。另外，对于管20的材质，若选择透过磁力的物质、或非磁性体，则在使磁性粒子通过管20的情况下等，通过从管20的外部给予磁力能够容易地使磁性粒子移动，因此优选。另外，由于在附近配置加热器(后述的第一加热器65A)，所以优选管的材质具有至少100°C以上的耐热性。此外，管20的材质可以与罐的材质相同。
[0040]管20具有清洗液液柱45、溶出液液柱47以及油液柱。由于结合有核酸的磁性粒子?被外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁沿着管20在外部移动，从而磁性粒子7在管20内移动，并且经过清洗液液柱45而到达溶出液液柱47。与磁性粒子7结合的核酸在清洗液液柱45被清洗液清洗，在溶出液液柱47溶出。这里，“液柱”是指:在管20内，特定液体占据一区域时的液体。例如，将在图2A?图2C中的毛细管23内保持为柱状的液体称为“液柱”。此外，油与其他溶液相分离(不与其他溶液混和)，因此，由油构成的液柱具有防止其两侧的水溶性的液柱相互混合的功能。虽然优选在液柱之中、液柱之间没有气泡或其他液体，但是只要磁性粒子7能够通过液柱，也可以存在气泡、其他液体。
[0041]虽然油的种类并不特别限定，能够使用矿物油、硅油(2CS硅油等)、植物油等，但是通过使用更高粘度的油，在与上侧的液柱的界面使核酸结合性固相载体移动的情况下，能够提高由油产生的“擦拭效果”。由此，在使核酸结合性固相载体从上侧的液柱移动至由油构成的液柱的情况下，能够使附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分更加难以进入油内。
[0042]热循环处理在盒I的PCR容器30中进行。PCR容器30由油充满，由于溶出液47与该油相分离，所以若从管20将溶出液液柱47压出至PCR容器30中，则成为液滴状，另外，由于比重比油大，所以成为液滴状的溶出液47沉降。若通过外部的加热器在PCR容器30形成高温区域36A与低温区域36B，并且反复使盒I整体与加热器一起上下翻转，则液滴状的溶出液47交互地在高温区域36A与低温区域36B之间移动，从而对作为PCR溶液的溶出液47实施两阶段的温度处理。
[0043]PCR容器30的材质并不特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，由于在附近具有第一加热器65A，所以优选PCR容器30的材质为具有至少100°C以上的耐热性。若PCR容器30的材质选择透明或者半透明的材质则荧光测定(亮度测定)容易，因此优选。其中，不必使PCR容器30的全部区域都为透明或者半透明，只要至少与荧光测定器55对置的部位(例如PCR容器30的底35A)为透明或者半透明即可。此外，PCR容器30的材质可以与罐3、柱塞10的材质相同。
[0044]盒I由罐3与盒主体9构成。对于构成盒I的套件，与罐3以及盒主体9 一起预先准备附加器5。通过经由附加器5将罐3与盒主体9连接而组装盒I。其中，也能够构成为将罐3直接安装于盒主体9。
[0045]在以下的盒I的构成要素的说明中，如图2A所示，将沿着长条的盒I的方向设为“长度方向”，将罐3侧设为“上游侧”，将PCR容器30侧设为“下游侧”。此外，有时候也将上游侧简单地表示为“上”，将下游侧表示为“下”。
[0046](I)罐
[0047]图3A?图3D是罐3的说明图。
[0048]在套件中预先准备的罐3收容有溶解液41与磁性粒子7。在罐3的开口安装有能够取下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M异硫氰酸胍、2% Triton X 一 100、50mM Tris 一 HCl (pH7.2)。操作者拆下盖3A将罐3的开口敞开(参照图3B)，将附着有病毒的棉签浸于罐3内的溶解液41，使病毒被溶解液41提取(参照图3C)。在对罐3内的液体进行搅拌时，虽然也可以以图3C的状态振动罐3，但是由于这样溶解液41容易溢出，所以优选如图3D所示那样将带有盖5A的附加器5安装于罐3的开口然后振动罐3。由此，对罐3内的物质进行搅拌，通过溶解液41溶解病毒粒子，核酸游离，并且涂覆于磁性粒子7的二氧化硅吸附核酸。磁性粒子7相当于核酸结合性固相载体。然后，操作者将安装于罐3的开口的附加器5的盖5A拆下，经由附加器5将罐3安装于盒主体9 (参照图2A)。
[0049]罐3由具有挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。在柱塞10滑动而从图2A的状态成为图2B的状态时，能够抑制由于罐3膨胀而使管20内的液体的压力过度上升，从而能够抑制管20内的液体向下游侧压出。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。
[0050]此外，提取/扩增核酸的试料并不限定于病毒，也可以是细胞。细胞的由来也不特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织片、血液等。
[0051]另外，虽然溶解液41只要含有离液物质(力才卜口匕°、y夕)则并不特别限定，但是为了破坏细胞膜或者使细胞中所含有的蛋白质变性而含有表面活性剂。作为该表面活性剂，一般只要是在从细胞等提取核酸时所使用的物质即可，并不特别限定，具体而言，例举有Triton-X等氚核系表面活性剂、TWeen20等双晶系表面活性剂那样的非离子性表面活性剂、N-月桂酰肌氨酸钠(SDS)等阴离子性表面活性剂，特别优选以成为0.1%?2%的范围的方式使用非离子性表面活性剂。并且，优选使溶解液含有2 —巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原剂。虽然溶解液可以是缓冲液，但是优选为pH6?8的中性液。考虑上述内容，具体而言，优选含有3M?7M的胍盐、0%?5%的非离子性表面活性剂、OmM?0.2mM的EDTA、OM?0.2M的还原剂等。
[0052]离液物质只要具有在水溶液中产生离液离子(离子半径大的I价阴离子)并且增加疏水性分子的水溶性的作用，并且有助于核酸向固相载体吸附，则并不特别限定。具体而言，例举有异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，这些中，优选蛋白质变质作用强的异硫氰酸胍或者盐酸胍。上述离液物质的使用浓度根据各物质而不同，例如在使用异硫氰酸胍的情况下，优选为3M?5.5M的范围，在使用盐酸胍的情况下，优选使用5M以上。
[0053]另外，提取试料的器具并不特别限定，可以配合用途取代棉签而选择抹刀、棒、刮刀等。
[0054]虽然罐3的内容积并不特别限定，例如能够为0.1mL以上10mL以下。虽然罐3的材质并不特别限