核酸扩增方法
【专利说明】核酸扩增方法 发明领域
[0001] 本发明处于分子生物学领域，特别是核酸扩增领域并且更特别是恒温核酸扩增领 域。
[0002] 发明背景
[0003] 聚合酶链反应（PCR)革新了我们做生物研宄的能力，并且它已经广泛用于生物医 学研宄和疾病诊断中。手持式诊断装置是当前需要的，其可用于在野外和护理现场检测病 原体。然而，对大功耗热循环的需要限制了在这种情况下的PCR应用。已经开发了几种恒 温靶扩增方法。链置换扩增（SDA)将限制性核酸内切酶对其靶DNA的未修饰链切口的能力 与缺乏核酸外切酶的DNA聚合酶在所述切口处延伸3'端和置换下游DNA链的作用相结合。 转录介导扩增（TM)利用RNA聚合酶从引物区中工程制定的启动子制作RNA，利用逆转录酶 从RNA模板产生互补DNA和利用RNase H从cDNA除去RNA。在滚环扩增（RCA)中，DNA聚 合酶在圆形模板上延伸引物，生成所述模板的互补序列的串联连接拷贝。然而，这些恒温核 酸扩增方法也具有它们的局限性。它们中的大多数具有复杂的反应方案。另外，它们不能 扩增对于许多研宄和诊断应用有用的足够长度的DNA靶。
[0004] 在活的有机体中，DNA解旋酶用于在DNA复制期间将两个互补DNA链分开。通过 模拟自然，开发了新的恒温DNA扩增技术，解旋酶依赖性扩增（HDA)。HDA利用DNA解旋酶 分开双链DNA (dsDNA)并产生单链模板供引物杂交和随后的延伸。因为DNA解旋酶以酶促 解旋dsDNA，PCR所需要的初始热变性和随后的热循环步骤全部能够省略。因此，HDA提供 了简单的DNA扩增方案：反应自始至终一种温度。
[0005] 双链DNA的链首先由DNA解旋酶分开并被单链DNA (ssDNA)结合蛋白包被。在第 二步中，两个序列特异性引物与所述DNA模板的每个互补链杂交。然后利用DNA聚合酶延 伸与所述模板退火的引物以产生双链DNA，然后利用所述两个新合成的DNA产物作为DNA解 旋酶的底物，进入下一轮反应。因而，开展了同时的链式反应，导致选定靶序列的指数式扩 增。
[0006] 用于嗜热HDA(tHDA)的解旋酶属于体内错配修复系统。大肠杆菌（E. coli)系统 需要多种辅助蛋白（例如，至少mutS、mutL和mutH)在失配位点附加产生切口，然后负载 UvrD，UvrD具有结合核酸分子末端的高亲合性。然而，从制造观点来看，纯化这么多的辅助 蛋白来实行体外扩增将是过于昂贵的。
[0007] 解旋酶利用水解核苷三磷酸（例如ATP)产生的能量来破坏在双链体DNA和RNA中 将链保持在一起的氢键。解旋酶参与细胞中核酸代谢的每个方面，包括DNA复制、修复、重 组、转录和蛋白质翻译。解旋酶可根据解旋机制分为两类：以5'至3'方向转位的那些和以 相反的3'至5'方向行进的那些。5'至3'解旋酶通常形成六聚体环结构并主要参与DNA 复制。
[0008] 用于HDA反应的UvrD解旋酶来自于3'至5'转位蛋白的类别。这些蛋白作为单体 或二聚体存在，并且与许多其他解旋酶不同，UvrD解旋酶能够完全地解链双链体分子（有 平端的DNA片段）和带切口的环状DNA分子。UvrD参与两种主要的DNA修复途径：甲基指 导的错配修复和UvrABC介导的核苷酸切除修复。在甲基指导的错配DNA修复途径中，召集 UvrD解旋含有DNA生物合成错误的DNA链。
[0009] 在tHDA中，扩增步骤在升高的温度下发生。
[0010] 聚乙二醇（PEG)通过排除水和与溶质聚阳离子产生静电相互作用，已用于 产生人造的分子拥挤条件（Miyoshi 等，Biochemistry 41:15017-15024(2002))。当 PEG6000(7.5% )加入DNA连接反应时，反应时间减少到5min(Quick Ligation Kit，New England Biolabs， Inc. (Beverly，Mass·))〇
[0011] 除了甜菜碱、海藻糖、山梨糖醇、DMSO或BSA外，PEG8000例如是PCR反应的一种常 用和已知的增强剂。然而在HDA或tHDA反应中，最普遍使用的PCR增强剂如海藻糖、DMSO 或山梨糖醇，不引起任何反应改善。恰恰相反，甜菜碱或PEG8000却显著减慢反应，分别彻 底抑制反应。
[0012] 因此，提供能够改善反应的HAD或tHDA反应的添加剂将会是有帮助的。
[0013]
[0014] 术语"核酸"是指双链或单链DNA、RNA分子或DNA/RNA杂交分子。作为双链核酸 分子的那些分子可以是有切口的或完好的。所述双链或单链核酸分子可以是线性或环状 的。所述双链体可以是平端或具有单链尾的。单链分子可以具有发夹或环和茎形式的二级 结构。核酸可以从各种各样的来源分离，包括环境、食品、农业、发酵、生物体液例如血液、乳 液、脑脊液、痰、唾液、大便、肺吸出物、粘膜组织拭子或者组织样品或细胞。核酸样品可以 从细胞或病毒获得并且可以包括下列的任何：染色体DNA，染色体外DNA包括质粒DNA，重 组DNA，DNA片段，信使RNA，转移RNA，核糖体RNA，双链RNA，或在细胞或病毒中出现的其他 RNA。核酸可以分离、克隆或通过化学合成体外合成。任何上述核酸都可以经受修饰，其中 核酸内的个体核苷酸被化学变更（例如，通过甲基化）。修饰可以天然发生或通过体外合成 发生。术语"双链体"是指完全或部分双链的核酸分子。
[0015] 术语"靶"或"模板"核酸是指被选择性扩增并通过3'和5'边界限定的核酸整体 或部分。靶核酸也可以称为打算被扩增的片段或序列。待扩增的靶核酸的大小可以，例如， 在大约或至少50至1000、50至500、50至250、75至150碱基或千碱基的范围内。靶核酸 可以包含在更长的双链或单链核酸内。或者，靶核酸可以是整体双链或单链的核酸。模板 也可以是修饰的核酸，例如通过有机基团例如甲基、生物素、甲醛修饰的核酸，等等。
[0016] 如果RNA用作模板，则在开始HDA之前必须实行反转录成cDNA。⑶NA的合成可以 在HDA之前在不同的反应和/或不同的反应环境下实行（两步过程）或可在HDA试剂内实 行（一步过程）。靶核酸在扩增之前可以是损伤的并可以修复（例如无碱基位点的修复）。 靶核酸可以没有引物结合位点。在这种情况下，缺失的引物结合位点可以通过例如连接来 附上，以便可实行HDA。
[0017] 术语"解链"、"解旋"或"变性"是指核酸双链体的两个互补链全部或部分分开。
[0018] 术语"杂交"是指在引物只特异性结合一条模板链上它的互补序列、而不结合所述 模板中其他区域的条件下，寡核苷酸引物与单链核酸模板的区域结合。杂交的特异性尤其 可以受到寡核苷酸引物的长度、实行杂交反应的温度、离子强度、GC含量和pH的影响。
[0019] 术语"引物"是指能够与靶核酸上的单链区域结合以促进所述靶核酸的聚合酶依 赖性复制的单链核酸。本发明设想了利用正向和反向引物。优选地，本文中描述的引物在 HDA反应的任何给定阶段中（例如，在解链、杂交/退火和/或延伸期间），不会或预计不会 形成完全或部分发夹的二级结构。
[0020] 通常，适合用于HDA中的引物对是短合成寡核苷酸，例如，具有准确地、大约或至 少 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、或更多个核苷酸碱基的长度。优选所述引物 在大约5和60、10和50、15和30个核苷酸碱基之间。
[0021] 寡核苷酸引物设计包括各种参数，例如基于字符串的比对得分、解链温度、引物长 度和GC含量（Kampke等，Bioinformatics 17:214-225(2003))。当设计引物时，重要因素 之一是选择靶片段内对于待扩增的核酸分子特异性的序列。其他重要因素是决定用于HDA 反应的引物的解链温度。引物的解链温度由该寡核苷酸的长度和GC含量确定。优选所述 引物的解链温度超过或低于将发生杂交和扩增的温度准确地、大约或至少3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50摄氏度。更优选地，所述解链温 度低于HDA的杂交或扩增温度大约10摄氏度至高于HDA的杂交或扩增温度30摄氏度，或者 低于HDA的杂交或扩增温度15摄氏度至高于将发生杂交或扩增的温度25摄氏度。例如， 当使用大肠杆菌UvrD解旋酶制剂时，如果杂交和扩增的温度设定在37摄氏度，则设计用于 该反应的引物对的解链温度应该在约27摄氏度至约67摄氏度之间的范围内。
[0022] 在某些实施方式中，当杂交和扩增的温度是60摄氏度时，设计用于该反应的引物 对的解链温度应该在45和90摄氏度之间的范围内。为了选择HDA反应的最佳引物，可在 平行试验中测试具有各种解链温度的一组引物。关于引物设计的更多信息由Kampke等， Bioinformaticsl7 :214-225(2003)描述。
[0023] 术语"辅因子"是指解旋酶解旋活性所需要的的小分子作用剂。解旋酶辅因子包括 三磷酸核苷（NTP)和脱氧三磷酸核苷（dNTP)和镁（或者其他二阶阳离子）。例如，ATP (三 磷酸腺苷）可以在〇. I-IOOmM范围内并优选在1至IOmM范围内（例如3mM)的浓度下，用 作U