用于修饰的核苷酸的氧化剂的制作方法
【专利说明】用于修饰的核苷酸的氧化剂
[0001] 本发明涉及尤其是氧化剂的试剂，用于检测修饰的胞嘧啶残基、以及分析和/或 测序包含修饰的胞嘧啶残基的核酸。
[0002] 5-甲基胞嘧啶（5mC)是充分研宄的、在基因沉默和基因组稳定性中起重要作用 的表观遗传 DNA标记，并发现其富集于CpG二核苷酸中（1)。在后生动物中，5mC可通过 10-11易位（TET)家族的酶被氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC) (2, 3)。5hmC的整体水平大 概比5mC的整体水平低10倍，并在组织之间变化（4)。相对高数量的5hmC(所有胞嘧啶~ 0. 4% )存在于胚胎干（ES)细胞中，其中5hmC被认为在建立和/或维护多能性中发挥作用 (2, 3, 5-9)。5hmC已被提议在活跃的DNA脱甲基中作为中间体，例如通过脱氨基，或经由利 用TET酶进一步将5hmC氧化为5-甲酰基胞嘧啶（5fC)和5-羧基胞嘧啶（5cC)、随后是涉 及胸腺嘧啶-DNA糖基酶（TDG)的碱基切除修复或在复制中未被保持标记（10)。然而，5hmC 本身也可构成表观遗传标记。
[0003] 在总基因组DNA中，通过包括薄层色谱法和液相色谱-串联质谱法的分析方法检 测和定量5hmC的水平是可能的（2, 11，12)。因此，映射5hmC的基因组位置迄今为止是通过 富集法实现的，该富集法采用用于DNA片段的5hmC特异性沉淀的化学物质或抗体，然后对 DNA片段进行测序（6-8、13-15)。这些拉下（pull-down)方法具有相对较差的分辨率（IOs 至IOOs的核苷酸），并且只给出相对的定量信息，这在富集中有可能受到分布式偏见。可量 化的5mC的单核苷酸序列已使用重亚硫酸盐测序（BS-Seq)完成，所述重亚硫酸盐测序利用 重亚硫酸盐介导的脱氨基作用将胞嘧啶转化为尿嘧啶，对应于这种脱氨基作用的5mC的转 化是较慢的（16)。但是，人们已经认识到，5mC和5hmC在重亚硫酸盐反应中脱氨基都是很 慢的，因此这两个碱基不能够被区分（17,18)。两个相对新的和简洁的单分子方法在单核苷 酸分辨率中检测5mC和5hmC时显示出希望。单分子实时测序（SMRT)已经示出能在基因组 DNA中检测衍生的5hmC(19)。然而，必须对包含5hmC的DNA片段进行富集，但该富集将导 致定量信息损失（19)。即使SMRT具有较低的精确度（19)，但仍可通过其检测5mC。此外， SMRT具有相对高的测序错误比率（20)，且修饰的峰值呼叫（calling)是不精确的（19)，并 且平台还不能测序整个基因组。蛋白质和固态纳米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用进 一步的开发，有可能测序未扩增的DNA分子（21，22)。
[0004] 已经报道了使用"氧化重亚硫酸盐"测序（"oxidative bisulfite" sequencing) (oxBS-Seq)的方法（23)在单核苷酸分辨率上对基因组DNA中的5hmC和5mC进行定量映 射。这些方法涉及使用高钌酸钾（KRuO 4)将5hmC特异性氧化为5fC。
[0005] 本发明的发明人已经意识到例如为钌酸根的金属（VI)氧基络合物（metal ( VI) OXO complexe)在催化将多核苷酸中的5hmC残基选择性氧化为5fC残基时是有用的。例 如，这在"氧化重亚硫酸盐"分析和测序的方法中可能是有用的。
[0006] -方面，本发明提供了一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所 述方法包括：
[0007] ( i )提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
[0008] ( ? )用金属（VI)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
[0009] (iii)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
[0010] ( iv )识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一核苷酸序 列和第二核苷酸序列中的残基。
[0011] 在某些实施例中，所述残基可通过测序被识别。例如，一种识别样本核苷酸序列中 修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法可以包括：
[0012] ( i )提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
[0013] ( ii )用金属（VI)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
[0014] (iii)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，
[0015] (iv)在步骤ii )和步骤iii)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核 苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后
[0016] ( V )识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第一核苷酸序列和所 述第二核苷酸序列中的残基。
[0017] 合适的测序方法在本领域中是已知的，并在下文详细描述。
[0018] 在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被识别的残基可以表明样本核苷酸序列 中对应位置处的修饰的胞嘧啶，即，样本核苷酸序列中某一位置处的修饰的胞嘧啶的存在 可以根据位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中相同位置处的残基的类别（identity) 来测定。
[0019] 例如，胞嘧啶残基可以存在于样本核酸序列中一个或多个位置处。在第一核苷酸 序列和第二核苷酸序列的对应位置处的残基可以被识别。可以由样本核苷酸序列中胞嘧啶 所在位置处的分别在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被识别的残基的组合（即C和C、 U和U、C和U、或者U和C)来测定样本核苷酸序列中胞嘧啶上例如5-取代的修饰的存在， 例如5-甲基或5-羟甲基取代。通过不同组合所表明的胞嘧啶的修饰如表1所示。
[0020] 用金属（VI)氧基络合物进行处理能将多核苷酸的第一部分中的5-羟甲基胞嘧 啶（5hmC)残基氧化为5-甲酰基胞嘧啶（5fC)残基。随后通过步骤（iii)的重亚硫酸盐处 理能将多核苷酸的第一部分中的5fC残基转化为尿嘧啶。在一些实施例中，用金属（VI) 氧基络合物进行处理可以进一步将一些或所有5-甲酰基胞嘧啶（5fC)残基氧化为5-羧基 胞嘧啶（5caC)残基。通过步骤（iii)的重亚硫酸盐处理也能将多核苷酸的第一部分中的 5caC残基转化为尿嘧啶。
[0021] 金属（VI )氧基络合物包括与一个或多个氧原子相配位的+6价氧化态的金属原 子（M) 〇
[0022] 金属（VI )原子可以是三配位的或四配位的，即M6+原子可以与三个氧原子相配 位（例如氧化铼Rh (VI)O3),或在含氧阴离子中与四个氧原子相配位（例如钌酸根Ru (VI) 〇，)。
[0023] 在优选实施例中，金属（VI)原子在含氧阴离子（MO42O中与四个氧原子相配位， 优选以四面体构型相配位。合适的金属（VI)氧基络合物包括锰酸根（Mn(VI)0，)、高铁酸 根（Fe (VI) O42O、锇酸根（Os (VI) O42O、钌酸根（Ru(VI)O42O 或钼酸根（Mo (VI) O42O。
[0024] 在一些优选实施例中，金属（VI)氧基络合物为钌酸根（Ru(VI)O4 2O或锰酸根 (Mn (VI) O42O，更优选为钌酸根（Ru (VI) 04勹。
[0025] 可以通过任意合适的技术制备金属（VI)氧基络合物，并且本领域中多种方法都 是可用的。
[0026] 例如，在氧化羟甲基胞嘧啶（hmC)时适合使用的金属（VI)氧基络合物（M(VI) O42O可以通过相应的金属（VII)氧基络合物或金属（VIII)氧基络合物（例如M(VII)CV或 M(VIII)O4)的还原来制备。可以采用任何合适的还原方法，例如加热或使用氢氧化物或过 氧化离子进行处理。适合的金属（VI)氧基络合物（M(VI)O 42O也可以通过金属氧化物和 氧基络合物（例如MO2)的氧化来制备。
[0027] 例如，可以通过还原过钌酸根（Ru(VII)CV)或四氧化钌（Ru(VIII)O4)很方便地制 备钌酸根（Ru(VI)O 42O，例如使用碘化物、氢氧根（0Γ)、过氧根（0广）或通过加热来还原。还 可以通过钌化合物的氧化很方便地制备钌酸根，例如使用疆11〇 4或HClO (次氯酸）来氧化。 也可以由三氧化钌（RuO3)制备钌酸根（Ru (VI)O42O,例如使用碱水和过硫酸盐来氧化。
[0028] 可以通过使用氢氧根（0Γ)、过氧根（0广）或加热来还原高锰酸根（Mn(VII)CV)从 而很方便地制备锰酸根（Mn (VI) 04勹。
[0029] 可以通过使用氢氧根来还原Os(VIII)O4W而制备锇酸根（[Os(VI)O 4(OH)2]2)， (Os (VIII) 04+20Γ-> [Os (VI) O4 (OH)2]勹。
[0030] 可以通过加热充满硝酸钾的铁肩、或在碱性条件下加热氢氧化铁（III)和次氯酸 盐、或通过碱性次氯酸氧化硝酸铁来制备高铁酸根（Fe(VI)O 42O。
[0031] 可以通过在碱中分解三氧化钼来制备钼酸根（Mo(VI)O42-)，（Mo0 3+2Na0H -Na2MoO4 ?乳0) 〇
[0032] 下文会更详细地描述用于制备钌（VI)氧基络合物和锰（VI)氧基络合物的合适 方法的实施例。
[0033] 还可以由商业来源（例如，阿法埃莎（Alfa Aesar)，马萨诸塞州MA，美国USA ;西 格玛奥德里奇（Sigma Aldrich)，美国）获得金属（VI)氧基络合物。
[0034] 用金属（VI )氧基络合物进行处理，以选择性地将多核苷酸群体的第一部分的 5_羟甲基胞嘧啶残基氧化为5-甲酰基胞嘧啶残基。在多核苷酸中，基本上没有其它官能团 被金属（VI)氧基络合物氧化。因此，所述处理没有导致所存在的任何胸腺嘧啶或5-甲基 胞嘧啶残基进行反应。
[0035] 可以用充足浓度的金属（VI )氧基络合物处理多核苷酸的第一部分，以选择性氧 化多核苷酸中5-羟甲基胞嘧啶残基。可以使用标准技术很容易地测定用于选择性氧化 5-轻甲基胞喃啶的金属（VI)氧基络合物的合适浓度。例如，可以采用0.1 mM至10mM，更 优选大约ImM的钌酸根。
[0036] 典型地，用于本文所述方法的金属（VI)氧基络合物以浓缩的贮存液进行储备，所 述贮存液的浓度例如可以是处理多核苷酸的第一部分时所用浓度的5倍、10倍、100倍、150 倍或500倍。典型的贮存液可以为IOOmM至150mM。
[0037] 通过金属（VI)氧基络合物氧化hmC残基没有将第一部分中的多核苷酸降解或损 害到会阻止第一部分进行后续扩增和/或测序的程度，即，在用金属（VI)氧基络合物进行 处理后，第一部分包括足够的完整无缺的或未受损害的多核苷酸以允许扩增和/或测序， 即第一部分没有被完全降解。
[0038] 优选地，金属（VI)氧基络合物没有引起、或只引起最低限度的第一部分中多核苷 酸的降解或损害，或没有引起很大程度上的多核苷酸的降解或损害。
[0039] 多核苷酸的损害或降解可以包括磷酸二酯键的裂解、5'位脱磷酸和/或脱嘌呤。 用金属（VI)氧基络合物进行处理可能不会引起很大程度上的第一部分中多核苷酸的磷酸 二酯键的裂解、5'位脱磷酸、脱嘧啶和/或脱嘌呤，优选地只引起最低限度的、或没有引起 磷酸二酯键的裂解、5'位脱磷酸和/或脱嘌呤。
[0040] 用金属（VI)氧基络合物进行处理可能导致形成一些对应的5-羧基胞嘧啶产物 以及5-甲酰基胞嘧啶。这些产物的形成不会对本文所述的识别方法产生负面影响。在将 5-甲酰基胞嘧啶转化为尿嘧啶所使用的重亚硫酸盐的反应条件下，观察到5-羧基胞嘧啶 也被转化为尿嘧啶。可以理解的是，所提及的通过氧化5-羟甲基胞嘧啶而获得的5-甲酰 基胞嘧啶可以是还包含有也通过氧化5-羟甲基胞嘧啶而获得的5-羧基胞嘧啶的产物。
[0041] 有利地，处理条件还可以使多核苷酸维持在变性状态，即可以采用变性条件。合适 的条件能在没有引起多核苷酸损害或降解的情况下引起变性。例如，可以在碱性条件下，例 如50mM至500mM的NaOH或50mM至500mM的KOH条件下，用金属（VI)氧基络合物处理多 核苷酸。
[0042] 在用金属（VI)氧基络合物处理之后，可以对第一部分的多核苷酸进行纯化。 可以使用任何合适的核酸纯化技术进行纯化。合适的核酸纯化技术包括旋转柱层析 (spin-column chromatography)〇
[0043] 多核苷酸可以经受进一步的、用金属（VI)氧基络合物处理的重复处理。进行这 样的步骤以最大化地将5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰基胞嘧啶。这对多核苷酸具有足够 的、能够进行再热处理的二级结构可能是必要的。多核苷酸的任何热处理过的部分均可以 限制或阻止金属（VI)氧基络合物进入到那部分的结构中，这具有保护5-羟甲基胞嘧啶免 受氧化的效果。
[0044] 在一些实施例中，多核苷酸群体的第一部分例如可以经受用金属（VI )氧基络合 物