038] 图4g为积雪草酸钠盐在DMS0-d6*的完整13C-NMR谱图。
[0039] 图4h为积雪草酸钠盐13C-NMR谱的放大图。
[0040] 图5a为积雪草酸的PXRD谱图。
[0041] 图5b为积雪草酸钠盐的PXRD谱图。
[0042] 图6为积雪草酸的FTIR谱图。
[0043] 图7为积雪草酸钠盐（AJF09, 82)的FTIR谱图。
[0044] 图8为积雪草酸钠盐（AJF09, 99b)的FTIR谱图。
[0045] 图9为积雪草酸钠盐（AJF09, 99a)的FTIR谱图。
[0046] 图10为积雪草酸的热重分析（TGA)图。
[0047] 图11为积雪草酸钠盐（AJF09, 82)的热重分析（TGA)图。
[0048] 图12为积雪草酸钠盐（AJF09, 99b)的热重分析（TGA)图。
[0049] 图13为标准线形曲线。
[0050] 图14为制备积雪草苷的过程的图示表征。
[0051] 图15为医药级纯度的积雪草酸的制备过程的图示表征。
[0052] 图16a为积雪草酸钾盐的1H-NMR谱图。
[0053] 图16b为积雪草酸与氨基丁三醇所成盐的1H-NMR谱图。
[0054] 图16c为积雪草酸磷酸酯的钠盐的1H-NMR谱图。
[0055] 图16d为积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物的1H-NMR谱图。
[0056] 图17a为积雪草酸钾盐的质谱图。
[0057] 图17b为积雪草酸与氨基丁三醇所成盐的质谱图。
[0058] 图17c为积雪草酸磷酸酯的钠盐的质谱图。
[0059] 图17d为积雪草酸三乙酸酯的酰胺衍生物的质谱图。
【具体实施方式】
[0060] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0061] 根据上述问题，本发明人提供了一种易于实现的获得高纯度适合药理学研究的积 雪草苷和积雪草酸的方法。此外，他们还制备和鉴定了积雪草酸盐。这些盐的物理性质均 能达到制剂要求，且符合治疗炎症和纤维化疾病的要求。
[0062] 实施例1制备积雪草酸和积雪草酸盐
[0063] I .制备医药级纯度的积雪草酸
[0064] A.制备纯度为92 %的积雪草苷
[0065] 粗品积雪草苷粉末可以从市面购得，比如从广西昌洲天然产物开发有限公司 (www. changzhou-centella. com)贝勾买。
[0066] 首先向粗品积雪草苷粉末中加入4X60% (V/W)EtOH，然后将混合物加热至70~ 90°C (例如，80°C )，保持体系回流，直至固体溶解。待溶液冷却后，于5°C冷藏室内放置16 小时，使其结晶。体系中有无定型沉淀生成，过滤，回收的沉淀用60%的乙醇洗涤，直至颜色 变白。再将该沉淀于55~70°C (例如，60°C )、压力-0· 09~-0· IlMPa(例如，-0· IOMPa) 下烘干。
[0067] 向上述所得干燥固体中，加入30X80% (V/W)丙酮水溶液，加热回流1小时，至固 体溶解。过滤，将滤液置于KTC冷藏室内结晶24小时。体系中产生无定型沉淀，过滤，将 回收的沉淀用80%的丙酮洗涤，直至颜色变白。将该沉淀干燥后碾碎，即得积雪草苷粉末。 图14为本操作过程的简图。
[0068] B.制备纯度为98 %的积雪草酸
[0069] 将200g用上述方法制得的积雪草苷（纯度约92% )溶解于8X(V/W)4% Na0H/50% EtOH溶液中（1600ml)，所得溶液于80°C水浴中加热回流3~4小时，冷却至室 温或者接近室温。
[0070] 然后，通过在搅拌下分批少量（例如，每次加 IOml左右）加入稀盐酸（预稀释1~ 2倍），调节该溶液的pH至4~5。在此过程中，不断有沉淀生成，最后，整个体系成为粘稠 的糊状。
[0071] 将该糊状物用直径为200mm的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，沉淀用水多次减压洗涤， 直至洗涤液接近无色。再用30%的乙醇洗涤，直至洗涤液接近无色。两次的洗涤液均弃去。
[0072] 向上述滤渣中加入8X (V/W)无水乙醇（约1600ml)，将体系于80°C水浴中加热回 流，直至固体完全溶解。再加入2 X活性炭（约400g)，继续回流30分钟。用直径为200mm 的布氏漏斗趁热抽滤，除去活性炭。弃去用过的活性炭，再向滤液中加入与前次等量的活性 炭，回流30分钟，用直径为200mm的布氏漏斗趁热抽滤。
[0073] 滤液冷至室温，向其中分批加入水，每次约100_200ml，直至不再产生白色沉淀，所 需水的总体积约为4000ml。用直径为200mm的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，将漏斗内的白色固 体干燥后碾碎，即得纯度为98% (W/W)的积雪草酸。图15为本操作过程的简图。
[0074] II ·积雪草酸的药理活性
[0075] 用博莱霉素处理大鼠是建立纤维化动物模型的优选方法。如下更详细的描述，本 发明所述的积雪草酸和积雪草苷组合物显著提高了博莱霉素处理大鼠的存活率，而不管处 理是在博莱霉素给药后一天还是七天开始。由于传统的用于治疗肺纤维化的药物地塞米松 在同样的实验条件下并不能显著提高大鼠的存活率，因此这结果是意料不到的。
[0076] 由于地塞米松主要作用于炎症途径，所以本发明的实验结果表明积雪草酸和积雪 草苷除了具有对炎症反应的抑制作用以外，还对与纤维化相关或者直接涉及纤维化的其它 途径发挥作用。比如，如肺组织病理学的测定结果，积雪草酸降低了博莱霉素诱导的肺纤维 化程度。博莱霉素损伤后七天开始用积雪草酸处理比用地塞米松处理更有效，表明积雪草 酸不仅靶向炎症反应，而且比地塞米松更直接地作用于纤维化。
[0077] 比地塞米松好得多，不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是七天开始，积雪草酸 和积雪草苷都显著降低博莱霉素诱导的肺纤维化，该肺纤维化通过肺重体重比来衡量。
[0078] 通过测定血清中羟脯氨酸（胶原蛋白的前体）和III型胶原蛋白的水平，积雪草酸 和积雪草苷也能显著降低博莱霉素诱导的纤维化。不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是 七天开始，积雪草酸的效果都与地塞米松相当或者略优于地塞米松。
[0079] 不管处理是在博莱霉素损伤后一天还是七天开始，积雪草酸都显著降低博莱霉素 诱导的介导纤维化的细胞因子转化生长因子β (TGF-β)和肿瘤坏死因子a (TNF-Ci)的血 清水平，这和地塞米松相当。
[0080] III.治疗适应症和剂型
[0081] 实验结果充分显示，按照本发明所述的方法制备的医药级纯度的积雪草酸和高纯 度的积雪草苷在治疗炎症相关疾病以及纤维原细胞和细胞基质积累相关疾病（"纤维化疾 病"）中的有效性。这些炎症疾病例如为：银屑病、炎症性肠病（包括克罗恩氏病和溃疡性 结肠炎）以及关节炎（包括风湿性关节炎、骨性关节炎和银屑病关节炎）。此类疾病的特点 在于机体免疫系统活动异常和炎症分子（如C0X-2、某些细胞因子和前列腺素）水平的提 高。这类纤维化疾病例如为：放射性肺炎及纤维化、特发性肺纤维化以及糖尿病肾病（特征 在于肾脏纤维化）。
[0082] 因此，本发明的目的之一就是提供一种治疗性组合物，其是由高纯度的积雪 草酸或积雪草苷和其它常规使用的成分配制而成的药剂，尤其适合内用。本发明的治 疗性组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体、赋行剂或稳定剂，具体的请参见 Remington-The Science and Practice of Pharmacy 21sted. (2005)，只要积雪草酸或积雪 草苷的抗纤维效果不受组合物中其它成分不利影响。
[0083] 根据所需的给药方式，本发明的治疗性组合物可以是针剂，用于胃肠道外给药。为 此，本发明的治疗性组合物可以制备成水溶液，包含生理上可相容的缓冲溶液，如Hank' s 溶液、Ringer' s溶液或者生理盐水。
[0084] 本发明另外提供了一种固体制剂，该制剂可以由一种积雪草酸盐（见下一部分） 和药学上可接受的固体基质混合而成，适于口服、口含、舌下、直肠或阴道给药。可以将高纯 度的积雪草酸、积雪草苷或积雪草酸盐和一种或多种固体赋行剂混合，可能有时在加入适 当的辅料后，还选择研磨所得的混合物，再接着处理该混合物，从而制成本发明的治疗性组 合物的片剂或糖衣丸。合适的赋形剂为填充剂，如糖类（乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等）和 纤维素类，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、凝胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙 基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠（CMC)和/或聚乙烯基吡咯烷酮（PVP :p〇Vid〇ne)。还可以 加入崩解剂，如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或褐藻酸盐（如褐藻酸钠盐）。
[0085] 糖衣丸具有适当的包衣，可以使用浓缩糖溶液，其可以选择性地包含阿拉伯胶、滑 石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇（PEG)，和/或二氧化钛、漆溶液、和适当的 有机溶剂或混合溶剂。药片或糖衣中可加入染料或色素，用来区分或识别不同剂量活性成 分的组合物。
[0086] 本发明所涉及的治疗性组合物中，适于口服的有：明胶制成的硬胶囊以及用明胶 和增塑剂（如甘油或山梨醇）制成的密封软胶囊，来装载用高纯度积雪草酸或积雪草苷制 成的固体制剂。上文所述的硬胶囊可以含有活性成分和填充剂（如乳糖）、粘合剂（如淀 粉）和/或润滑剂（如滑石粉或硬脂酸镁），并选择性加入一种或多种稳定剂。在软胶囊 中，活性成分的存在方式可以是溶液或悬浮在适当的液体中的悬浮液，该适当的液体可为 脂肪油、液体石蜡或液体的聚乙二醇（PEG)，并选择性加入一种或多种稳定剂。<