弹性纤维双重染色显示，肺泡隔轻度增厚，并有少数成纤维细胞增生。
[0210] 模型组
[0211] 实验动物的肺部组织中存在炎症细胞浸润（主要是淋巴细胞）和肺泡隔增生。在 增厚病灶中，存在从中度到严重的肺泡隔局部增厚和成纤维细胞的中度增生。此外，还存在 着严重的肺泡炎，可能在终末细支气管周边部位发生纤维组织增生，以致在一些区域几乎 没有肺泡存在。在肺胸膜下还存在轻微的肺泡萎缩和肺气肿。
[0212] 胶原纤维和弹性纤维双重染色显示，在肺组织中有大量胶原纤维和弹性纤维增 生。在某些区域几乎没有肺泡。一些气管壁上也具有胶原纤维和弹性纤维增生。内腔变小， 并且血管周围具有大量胶原纤维和弹性纤维的增生。
[0213] 地塞米松组
[0214] 肺组织中存在轻微的炎症细胞浸润（主要是淋巴细胞）。在肺泡中有少量炎症细 胞浸润，并且肺泡隔具有现轻微增生。成纤维细胞略有增生，有肺大泡形成，并且在肺胸膜 下还存在轻微的肺萎缩和肺气肿。
[0215] 胶原纤维和弹性纤维染色显示，肺组织中有少量胶原纤维和弹性纤维增生。
[0216] 积雪草苷组
[0217] 肺组织有轻微炎症和肺泡炎（主要是淋巴细胞）。肺泡隔略有增生，肺泡隔下发现 轻微的肺萎缩和肺气肿症状。以上病理变化的程度和范围与地塞米松组类似，但是没有模 型组严重。
[0218] 胶原纤维和弹性纤维染色结果与地塞米松组相似。
[0219] 积雪草酸低剂量组
[0220] 肺组织具有轻微炎症和肺泡炎（主要是淋巴细胞）。肺泡隔略有增生，且有少许增 厚，少量成纤维细胞增生，肺泡隔下有轻微的肺萎缩和肺气肿症状。以上病理变化的程度和 范围与积雪草苷组类似。
[0221] 胶原纤维和弹性纤维染色结果与地塞米松组相似。
[0222] 积雪草酸中等剂量组
[0223] 肺组织具有轻微的炎症细胞浸润（主要是淋巴细胞）。炎症蔓延到肺泡，肺泡隔略 有增厚和增生。成纤维细胞少量增生，肺泡隔下有轻微的肺泡萎缩和肺气肿症状。
[0224] 胶原纤维和弹性纤维染色显示纤维组织增生，但比模型组明显轻微。病理变化的 程度和范围在大部分大鼠中与低剂量组类似，但在该组的少量大鼠中比低剂量组轻微。
[0225] 积雪草酸高剂量组
[0226] 肺组织中具有轻微的炎症细胞浸润（主要是淋巴细胞）。炎症蔓延到肺泡，肺泡隔 略有增厚。成纤维细胞少量增生，肺胸膜下有轻微的肺泡萎缩和肺气肿症状。
[0227] 胶原纤维和弹性纤维染色显示仅有少量纤维组织增生，这在一些方面与空白组类 似。该组的病理变化轻于低剂量组、中剂量组和积雪草苷组。
[0228] 组2 (博莱霉素建模后七天开始给药）
[0229] 空白组和模型组的情况与组1 (建模后第二天开始给药）中相同组的类似。
[0230] 地塞米松组
[0231] 肺组织具有轻微的炎症细胞浸润（主要是淋巴细胞）。在肺泡中有少量炎症细胞 浸润，肺泡隔略微增厚。成纤维细胞轻微增生，有很多肺大泡形成，肺胸膜下存在轻微的肺 萎缩和肺气肿症状。病理变化明显比建模后第二天开始接受地塞米松组严重很多。
[0232] 胶原纤维和弹性纤维染色显示，肺组织具有纤维组织增生，且肺泡壁的厚度以及 纤维化程度都比建模后第二天开始接受地塞米松组严重很多。
[0233] 不同剂量的积雪草苷组和积雪草酸组的情况与博莱霉素建模后第二天开始接受 给药的组类似。
[0234] 5.分析
[0235] 博莱霉素诱导肺纤维化是一种用于研究肺纤维化机理和发现抗纤维化、抗炎症治 疗剂的"黄金标准"模型。许多动物经博莱霉素处理后肺发生的生物化学和形态变化看上去 与人类非常相似。博莱霉素处理激活的炎症和纤维化途径与炎症和纤维化疾病中的类似， 如糖尿病肾病（肾纤维化）。此外，Gauldie 等人（Proc. Am. Thorac. Soc. 3:696-702, 2006) 证实慢性阻塞性肺病（COPD)，包括肺气肿，依赖相同的一些不良调节途径。因此，本发明提 供如前文所述的治疗性组合物，用于治疗炎症和纤维化疾病，如关节炎、炎症性肠病、银屑 病、糖尿病肾病以及COPD。
[0236] 由于博莱霉素引起的肺炎以及之后的肺纤维化非常严重，模型组中50~70%动 物死亡。动物死亡应当与慢性炎症和纤维化引起的呼吸衰竭有关。地塞米松并不能使大鼠 免于博莱霉素引起的死亡，令人惊讶的是，积雪草苷和积雪草酸却在很大程度上阻止了博 莱霉素引起的死亡。
[0237] 结果也表明，积雪草酸能够降低TNF-α和TGF-β的水平，在最高剂量时，更加有 效。
[0238] 采用了常规的苏木精一伊红（HE)染色。还进行了胶原纤维和弹性纤维双重染色， 以更好的观察抗纤维化效果。病理结果表明，积雪草酸有效对抗了博莱霉素诱导的肺纤维 化，其效果与剂量有关。高剂量积雪草酸组的效果优于积雪草苷组，而中、低剂量积雪草酸 组的效果与积雪草苷类似。有趣的是，在建模后第二天和第七天开始地塞米松给药的两个 组之间有明显的病理区别：在第二天开始给药肺纤维化缓解更加显著。原因可能是由于地 塞米松通过抑制炎症发挥了抗纤维化作用。一旦发生了早期的炎症，地塞米松的效果就降 低。而积雪草酸和积雪草苷在初期的炎症阶段和后期的纤维化阶段都起作用，因此，在损伤 后第二天和第七天给药的这些组之间的效果变化不大。
[0239] 因此，纯的积雪草酸和积雪草苷显示了对博莱霉素诱导的炎症和纤维化的反作 用。
[0240] 经博莱霉素处理七天后开始给药，能够影响地塞米松的药效，但是并不能显著影 响积雪草酸和积雪草苷的效果，这表明积雪草酸和积雪草苷并不仅仅通过抑制发生在博莱 霉素处理后不久的炎症发挥作用。相反的，实验数据表明，积雪草酸和积雪草苷对于炎症和 纤维化过程都有直接的抑制作用。
[0241] 表8.积雪草酸抗纤维化实验中羟脯氨酸的测定值
[0242]
【主权项】
1. 一种积雪草酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在积雪草苷 粉末中加入8X4%Na0H/50%EtOH溶液，加热回流3-4小时，在所得水解产物中加入盐酸 调节pH至4-5抽滤，弃去滤液，将所得滤饼依次用水、30%EtOH溶液洗涤直到滤液接近无 色，弃去滤液，在所得滤饼中加入8X无水乙醇回流直到固体溶解，加入2X活性炭，回流30 分钟，趁热抽滤，弃去用过的活性炭，在滤液中加入2X活性炭回流30分钟，趁热抽滤，弃去 用过的活性炭，将所得滤液冷至室温，加水，直到没有新的沉淀生成，所得沉淀即为积雪草 酸，其中所述的百分比为质量体积比。2.如权利要求1所述的积雪草酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步 骤：将200g纯度约为92%的积雪草苷溶解于8 X 4%Na0H/50%EtOH溶液中，所得溶液于 80°C水浴中加热回流3~4小时，冷却至室温，通过在搅拌下分批少量加入稀盐酸，调节该 溶液的pH至4~5,在此过程中，不断有沉淀生成，最后整个体系成为粘稠的糊状，将该糊 状物用直径为200_的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，沉淀用水多次减压洗涤，直至洗涤液接近 无色，再用30%的乙醇洗涤，直至洗涤液接近无色，两次的洗涤液均弃去，向上述滤渣中加 入8X无水乙醇，将体系于80°C水浴中加热回流，直至固体完全溶解，再加入2X活性炭，继 续回流30分钟，用直径为200mm的布氏漏斗趁热抽滤，除去活性炭，弃去用过的活性炭，再 向滤液中加入与前次等量的活性炭，回流30分钟，用直径为200mm的布氏漏斗趁热抽滤，滤 液冷至室温，向其中分批加入水，每次约100_200ml，直至不再产生白色沉淀，所需水的总体 积约为4000ml,用直径为200mm的布氏漏斗抽滤，弃去滤液，将漏斗内的白色固体干燥后碾 碎，即得纯度为98%的积雪草酸，其中所述的百分比为质量体积比。3. -种积雪草酸氨基丁三醇盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤： 将2g积雪草酸和0.59g氨基丁三醇加入到30ml甲醇中，室温下搅拌24小时后，再回流0.5 小时，将体系浓缩，再加入少量水，有沉淀生成，过滤，将滤饼置于适量甲醇中，加热使之溶 解，过滤，除去不溶物，浓缩，向浓缩液中加入足量丙酮使体系均匀，冷却，有沉淀生成，过滤 后所得固体于50°C下干燥，得到1. 5g积雪草酸氨基丁三醇盐，为米色固体。4. 一种积雪草酸氨基丁三醇盐，其结构式如下所示：
【专利摘要】本发明公开了一种积雪草酸的制备方法、积雪草酸氨基丁三醇盐及其制备方法。积雪草酸的制备方法包括：在积雪草苷粉末中加入8×4％？NaOH/50％EtOH溶液加热回流，调节pH至4-5抽滤，滤饼依次用水、30％EtOH溶液洗涤，在所得滤饼中加入8×无水乙醇回流，两次加入活性炭回流，滤液冷至室温，加水得沉淀，即为积雪草酸。本发明生产积雪草酸及其氨基丁三醇盐较为便利，所得积雪草酸和积雪草酸氨基丁三醇盐的收率和纯度都很高。利用本发明公开的积雪草酸氨基丁三醇盐可用于治疗关节炎、银屑病以及其它炎症，还可用于治疗肺纤维化、糖尿病肾病等纤维化疾病，并且能够获得显著的疗效。
【IPC分类】C07C213/08, C07J63/00, C07C215/10
【公开号】CN105017373
【申请号】CN201410554049
【发明人】刘 英, 刘全海, 秦燕, 吴彤, 徐智儒, 刘珉宇, 李飞, 李燕, 迈克尔·J·纽曼
【申请人】上海医药工业研究院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2009年1月8日
【公告号】CN101969942A, EP2231139A2, EP2231139A4, EP2231139B1, US8742167, US20100331413, WO2009089365A2, WO2009089365A3