核磁共振仪上进行的，以便获取更加确切 的细节信息，同时也对初步测试的结果进行证实。通过对所得 1H-NMR和13C-NMR谱图（见 图4a~h)进行细致分析，可以看出，除了由于生成羧酸钠盐所引起的化学位移变化以外， 钠盐的结构相对于酸来说，没有发生变化。最显著的能够支持盐生成的化学位移的变化在 于：
[0144] a.积雪草酸的1H-NMR谱图中，在11. 9ppm的位置有一个氢的信号，通常对应羧基 中的氢。而在其钠盐的谱图中没有该信号。
[0145] b.在13C-NMR谱图中，羧基中碳原子的信号也发生了变化，这种变化可以用盐的生 成来解释。
[0146] D. X-射线粉末衍射
[0147] X-射线衍射实验所用仪器为Shimadzu Lab X，，XRD-6000,测试标准参见：美国药 典（USP)〈941〉。图5a为积雪草酸的衍射图，图中的宽峰为非晶体的特征峰。而按照前文 IV . A. 3中所述的方法，将钠盐的制备规模放大到2g，通过HPLC分析，获得如前述IV . B中的 结果，并且该钠盐的X-射线粉末衍射谱图与晶体的特征一致（参见图5b)。
[0148] E.傅立叶变换红外光谱图
[0149] 将积雪草酸、积雪草酸钠盐（AJF09, 82和AJF09, 99b)和积雪草酸铵盐 (AJF09, 99a)进行傅立叶变换红外光谱测试。图6为所得到的积雪草酸的红外光谱图，其中 1697cm 1附近的峰为典型的羧酸特征峰。
[0150] 钠盐AJF09, 82 (图7)和AJF09, 99b (图8)的红外谱图清楚地显示了 1697cm 1附 近羧酸特征峰的强度的减弱，以及1545cm1和1390cm 1附近峰的出现。产生这种变化的原 因在于与羧酸基团不同的羧酸盐基团的存在。这是支持积雪草酸盐生成的光谱学证据。铵 盐（AJF09, 99a)的红外谱图（图9)中存在1390cm 1附近的特征峰，同样证实了羧酸盐的存 在，该图中1690cm 1附近还存在羧酸的特征峰，这是由于从酸到盐转化不完全所造成的。
[0151] R热重分析（TGA)
[0152] 本发明中的TGA在Q5000型热分析仪上进行。仪器的校准参照美国药典（USP) 〈891〉，用镍标样进行。将积雪草酸和两种钠盐AJF09, 82和AJF09, 99b进行热重分析（实 验结果见图10~12)。从图中可以看出，积雪草酸在400°C开始分解，而两种钠盐则显示了 较佳的耐热性，这种现象在生成盐的变化中是比较常见的。
[0153] G.钠含量的测定
[0154] 测定钠含量所用仪器为Perkin Elmer AAnalyst 300型原子吸收分光光度计，其 中装有HGA 850型石墨炉，使用氧化空气一乙炔火焰，在波长为589nm处进行检测。通过 1000mg/L的氯化钠溶液配制钠的标准溶液。用本方法测定钠含量时，通常在碱金属（如铯） 的存在下进行，以便控制离子化的程度。因此，应首先用实验来确定铯（以氯化铯的形式存 在）的用量，这对于提高仪器对钠的敏感度非常必要。经实验确定，将0.3%的氯化铯用于 本发明的所有样品和标准品。
[0155] 标准氯化钠溶液I (1000 ppm Na)
[0156] 将精确称重的2. 53g氯化钠置于1.0 L的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶 解，再用去离子水稀释至刻度，即得所需氯化钠标准溶液。
[0157] 3 %的氯化铯溶液
[0158] 将精确称重的3g氯化铯置于IOOmL的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶解， 再用去离子水稀释至刻度，即得所需氯化铯溶液。
[0159] 0· 3 %的氯化铯溶液（稀溶液）
[0160] 将精确称重的6g氯化铯置于2. OL的容量瓶中，加适量去离子水使其全部溶解，再 用去离子水稀释至刻度，即得所需浓度的氯化铯溶液。
[0161] 稀释液1 (含IOOppm Na的0· 3%的氯化铯溶液）
[0162] 将10.0 ml标准氯化钠溶液I (1000 ppm Na)和10.0 ml浓度为3%的氯化铯溶液移 至100mL容量瓶中，再用去离子水稀释至刻度。
[0163] 稀释液2 (含IOppm Na的0· 3 %的氯化铯溶液）
[0164] 将10.0 ml稀释液1 (含IOOppm Na的0· 3%的氯化铯溶液）转移至100mL容量瓶 中，用0. 3%的氯化铯溶液（稀溶液）稀释至刻度。
[0165] 系统响应的线性
[0166] 测试系统的线性是指在一定范围内，该系统能够给出与测试样品的浓度成比例的 测试结果的特性。本发明中首先测定了吸光度和钠浓度的关系。在测试前，先配制好氯化纳 标准溶液，配制过程如下：分别精确转移2. 0ml、3. 0ml、4. 0ml、5. Oml和6. Oml稀释液2(含 IOppm Na的0. 3%的氯化铯溶液）至5个独立的50ml容量瓶中，用0. 3%的氯化铯溶液分 别稀释至刻度，从而制得浓度分别为〇· 4ppm、0. 6ppm、0. 8ppm、1.0 ppm和I. 2ppm的标准溶 液。在测试中，每种浓度的样品读数3次，以其读数的平均值作为该浓度的吸光度。以样品 的吸光度对其浓度作图，即可得到线性曲线（图13)。
[0167] 积雪草酸钠盐AJF09, 82和AJF09, 99b的测试结果如表3所示
[0168] 表3.积雪草酸盐中钠的含量
[0170] 如果假定每个积雪草酸盐分子对应一个钠离子，那么样品中钠的含量应该为 4. 5%〇
[0171] 实施例2所得产物的动物实验结果
[0172] 对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响
[0173] 1.目的
[0174] 为了观察积雪草酸和积雪草苷对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响，分别在疾 病动物模型建立以后的第二天和第七天给药。
[0175] 2.材料和方法
[0176] 动物：SD大鼠（雄性），体重250~300g，由上海SLACC有限公司提供；
[0177] TFG-β Kit，人 96T ELISA Kit 购自上海晶美；
[0178] TNF-a Kit，人 96T ELISA Kit 购自上海晶美；
[0179] 积雪草苷（纯度彡92% );
[0180] 积雪草酸（纯度> 98% )
[0181] 注射用博莱霉素，规格：8mg/Ap，由天津太河制药有限公司提供；
[0182] 地塞米松，规格：5mg/Ap，由上海信谊药业提供。
[0183] 3.剂量和给药途径
[0184] 积雪草酸 3、9和27mg/kg 口服（p.o.) X28天 积雪草苷 36 mg/kg p.o. X 28人 地塞米松 0.6 mg/kg p.o. X 28天 博莱霉素 5'mg/kg: .P:. ο... .X 2:8:天
[0185] 4.方法
[0186] 雄性SD大鼠，体重250~300g，用3%的西可巴比妥麻醉后，平放，固定在手术台 上。将其颈部用乙醇消毒，切开，露出气管。将注射针插入气管环之间的空隙中，注入5mg/ kg博莱霉素。保持大鼠坚立、旋转，使溶液均匀分散在肺中。缝合切口。
[0187] 待大鼠恢复意识后，随机分成两组：（i )动物模型建立后的第二天接受施药； (ii)动物模型建立后七天接受施药。两组中再分成以下各小组：27、9和3mg/kg p.o. X28 天积雪草酸组；0.611^/1^?.〇.\28天地塞米松组；3611^/1^?.〇.\28天积雪草苷组；模型 组和空白组。对模型组和空白组施用生理盐水。在施用积雪草酸和积雪草苷后第28天，计 算大鼠的存活率以及肺的重量占体重的百分比，并进行病理检查和血清检查。
[0188] 表4.试验第7-28天大鼠的死亡率
[0191] 积雪草酸处理对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺重指数的影响
[0192] 大鼠的体重和肺重在其死后测定。
[0193] 肺重比=(肺的重量/体重）X 100%
[0194] 结果见表5和表6。在下表中，一颗星（*)表示和模型组相比区别较明显 (Ρ〈0·05);两颗星（#)表示区别非常明显（Ρ〈0·01)
[0195] 表5.积雪草酸给药28天后的肺重指数（模型建立后第二天开始给药）
[0196]
[0199] 如表5和表6所示，建模后第二天或第七天开始给药的高、中、低剂量积雪草酸组 的大鼠的肺重指数均明显低于模型组。积雪草苷组的实验结果与积雪草酸组类似。地塞 米松组的肺重指数相对较高，很可能是由于地塞米松引起的体重降低造成的。
[0200] 积雪草酸处理对于博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠的细胞因子的血清学影响
[0201] 按照标准操作程序制备血清样本（样本采集后3000rpm离心10分钟），储存 于-20°C。按照试剂盒上的说明进行测试，结果见表7。
[0202] 表7.积雪草酸的血清试验结果
[0203]
[0204] 积雪草酸对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠的影响的病理分析
[0205] 肺组织在10%的福尔马林溶液中固定一周，其下叶经脱水和浸蜡后，进行石蜡包 埋和切片，切片厚度为3~4μπι。再进行常规的苏木精一伊红（HE)染色。进行胶原纤维和 弹性纤维双重特殊染色，以便确定纤维化的程度。观察两组切片的染色状况，结果如下。
[0206] 组1 (博莱霉素建模后第二天开始给药）
[0207] 空白组
[0208] 动物肺组织形态结构完整，没有出现出血、增生或水肿的现象。然而，在大多数动 物的肺组织中存在炎症细胞的浸润。在一些动物中情况比较严重并伴随局部充血。
[0209] 胶原纤维和