（将对应的氨基酸序列以 序列号34表不）。
[0155] 编码作为基于基础结构域（3)的合成蛋白质的例子的图9的氨基酸序列、且基于 双歧杆菌的密码子频率优化的基因的碱基序列如序列号35所示（将对应的氨基酸序列以 序列号36表不）。
[0156] 编码作为基于基础结构域（4)的合成蛋白质的例子的图10的氨基酸序列、且基于 双歧杆菌的密码子频率优化的基因的碱基序列如序列号39所示（将对应的氨基酸序列以 序列号40表不）。
[0157] 基于这样获得的基因序列而编码的基因，例如，能够通过公知的化学合成得到。作 为化学合成法，例如，可以列举通过利用亚磷酰胺法的DNA合成机进行化学合成的方法。另 外，基于所要获得的碱基序列的5'末端和3'末端的碱基序列制备引物，以从各种所来源生 物的组织或细胞中所含的mRNA合成的cDNA或选自cDNA文库的cDNA为模板，使用PCR法 进行DNA的扩增，由此，也能够获得上述的基因。另外，基于公知碱基序列信息，以将其全长 或一部分进行化学合成得到的DNA或多聚核苷酸为探针，对从各种所来源生物的组织或细 胞所含的mRNA合成的cDNA或cDNA文库进行集落杂交、嗜菌斑杂交，由此，也能够获得上述 的基因。
[0158] 另外，编码上述各蛋白质的基因也能够从公知的氨基酸序列信息容易地得到。作 为从公知的氨基酸序列信息得到编码上述各蛋白质的基因的方法，例如，可以列举使用具 有编码公知的氨基酸序列的基因的部分碱基序列的合成DNA引物，通过PCR法从上述cDNA 文库等扩增目标基因的方法；或通过将重组入适当的载体的基因与标记编码上述各蛋白质 的基因的一部分或全长的DNA片段或合成DNA的片段（探针）杂交来筛选的方法等。
[0159] 编码上述的各蛋白质的基因也可以是与如上所述获得的基因在严格条件下杂交 的DNA。能够在严格条件下杂交的DNA是指以上述DNA为探针，通过集落杂交法、嗜菌斑杂 交法或DNA印迹杂交法（southern blot hybridization)等得到的DNA。具体而言，可以列 举：使用将集落或嗜菌斑所来源的DNA固定化的过滤器，在约0. 7~1. 0M的氯化钠存在下， 在约65°C进行杂交之后，使用约0. 1~2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成 为含有150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠），在约65°C的条件下洗净过滤器，由此而鉴定的DNA。 作为上述能够杂交的DNA，具体而言，可以列举具有与基于上述公知碱基序列信息或氨基酸 序列信息得到的编码各蛋白质的基因的碱基序列具有至少80%的序列同一性的DNA、优选 具有至少90%的序列同一性的DNA、更加优选具有至少95%的相同性的DNA。
[0160] 2.免疫原性多肽表层表达框基因和双歧杆菌转化用载体的制备
[0161] 从如上所述制备的编码各蛋白质的基因制备含有免疫原性多肽表层表达框基因 或该免疫原性多肽表层表达框基因的重组体DNA。免疫原性多肽表层表达框基因可以如上 所述制备为编码目的免疫原性多肽的基因位于编码GLBP的基因的3'末端侧。本发明中， 重组体DNA可以为表达载体或染色体插入型载体（例如，同源重组型载体）。作为这样的 载体的制备中使用的质粒，只要是能够在双歧杆菌表达的质粒即可，没有特别限制。作为 源自双歧杆菌的质粒，可以使用 pTB6、pBL67、pBL78、pNAL8H、pNAL8M、pNACl、pBCl、pMBl、 pGBL8b等。也可以使用这些质粒与大肠杆菌的质粒的复合质粒，例如，可以列举pBLESlOO、 pKKT427、pRM2 等。
[0162] 从表达的稳定性和用于转化株的制备的DNA的制备的容易度的观点出发，上述质 粒之中，优选从长双歧杆菌的质粒和大肠杆菌的质粒合成的复合质粒。
[0163] 表达载体从选择转化株的观点出发，优选具有抗生素耐性、氨基酸要求性等选择 记D
[0164] 表达载体为了表达GLBP与目的免疫原性多肽的融合蛋白或有利于表达，优选添 加调节序列。作为调节序列，例如，可以列举启动子序列、前导序列、前肽序列、增强子序列、 信号序列、终止子序列等。这些调节序列只要能在双歧杆菌表达即可，其来源没有特别限 制。
[0165] 作为启动子序列，只要能够在双歧杆菌表达即可，没有特别限制。从表达效率的观 点出发，优选使用长双歧杆菌的组蛋白样蛋白（HU)的启动子序列、LDH启动子等。
[0166] 另外，从提高表达效率的观点出发，优选具有终止子序列。作为终止子序列，优选 使用上述HU基因的终止子序列。
[0167] 此外，根据需要，能够配置前导序列、前肽序列、增强子序列、信号序列等。另外，也 可以在编码GLBP的基因和编码目的免疫原性多肽的基因之间配置编码适当长度的接头的 基因。
[0168] 如上所述，在上述的质粒中，根据需要，导入启动子序列、终止子序列等调节序列 和选择标记基因，制备克隆载体。作为选择标记，可以列举壮观霉素（SPr)、氨苄青霉素 (Ampr)、四环素（TETr)、卡那霉素（KMr)、链霉素（STr)、新霉素（NEOr)等抗生素耐性标记； 绿色荧光蛋白质（GFP)、红色荧光蛋白质（REP)等荧光标记；LacZ等酶等。
[0169] 在克隆载体的启动子的下游，优选具备具有多克隆位点的接头等。通过使用这样 的接头，编码上述融合蛋白的基因（DNA)能够插入启动子的下游且在框内（in-frame)表达 融合蛋白。作为克隆载体用的质粒，例如，可以列举pBLES100、pBLEM100等（专利第3642755 号公报）。
[0170] 例如，通过在该质粒pBLESlOO中在框内（in-frame)插入上述获得的HU启动子序 列、编码GLBP的基因和编码目的免疫原性多肽的基因，得到在双歧杆菌的表层表达融合蛋 白的载体。以这样的方法得到的表达载体可以用于双歧杆菌的转化。
[0171] 作为双歧杆菌表层表达用载体，例如，也可以列举质粒pJTlOl (专利文献4和非专 利文献4)、和大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pJW241 (专利文献4和非专利文献4)。质粒 pJTlOl 含有长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)JCM1217(ATCC15707)所来源GLBP 基因 (序列号1和2 :专利文献4和非专利文献4)，能够在该GLBP基因的下游在框内（in-frame) 重组入编码目的免疫原性多肽的基因。另外，也能够将重组入PJT101的GLBP基因和编码 目的免疫原性多肽的基因的连结物（免疫原性多肽表层表达框基因）切出，重组入大肠杆 菌-双歧杆菌穿梭载体PJW241中。
[0172] 3.表达融合蛋白的转化双歧杆菌的制备
[0173] 能够将重组体DNA，例如如上所述制备的表达载体导入作为宿主的双歧杆菌，制备 转化双歧杆菌。
[0174] 在转化双歧杆菌的制备中，能够使用利用能够在双歧杆菌内复制的质粒的基因同 源重组法。根据基因同源重组法，能够将免疫原性多肽表层表达框基因（例如，在编码GLBP 的基因的3'末端侧连结有编码目的免疫原性多肽的基因的融合基因）插入双歧杆菌染色 体中。例如，可以使用具有与双歧杆菌染色体基因相同部位的温度感受性质粒（在高温（例 如，42°C以上）不复制的质粒）（例如，Appl. Microbiol. Biotechnol.，95卷，499-509页， 2012年）。更具体而言，在具有与双歧杆菌染色体基因相同部位的温度感受性质粒的相同 部位间插入免疫原性多肽表层表达框基因，将该质粒导入双歧杆菌，在高温培养，由此，能 够选择性地培养通过基因同源重组在染色体中重组入了该目标基因的双歧杆菌。
[0175] 在用于转化的表达载体或双歧杆菌内导入能够复制的质粒，只要是公知的方法即 可，能够使用任一种方法。具体而言，例如，可以列举电穿孔法（electroporation法）、磷酸 钙法、脂质体转染法、钙离子法、原生质体法、微注射法、基因枪法等。在本发明中，优选使用 电穿孔法。利用电穿孔法时，能够以0. 5~20kV/cm、0. 5 y sec~10msec的条件进行。例 如，以2~10kV/cm、50 y sec~5msec进行。
[0176] 转化株利用融合蛋白表达载体所具有的选择标记、能够在双歧杆菌内复制的质粒 的性质（例如，温度感受性）等来选择。作为培养转化株的培养基，可以列举分别适于宿主 微生物的培养基，例如，葡萄糖血液肝脏（BL)琼脂培养基、De Man-R〇g〇sa-Sharp(MRS)琼 脂培养基、岐阜大学厌氧性（GAM)琼脂培养基、改良GAM(TGAM)琼脂培养基、布氏（Briggs) 琼脂培养基、和酵母提取物葡萄糖蛋白胨（YGP)琼脂培养基。在这些培养基中根据选择标 记添加抗生素，或者缺失或添加氨基酸，作为选择压力。
[0177] 此外，培养条件优选以能够培养双歧杆菌的厌氧培养进行。通过在厌氧性条件下 培养，能够防止好氧性菌的增殖。厌氧性条件下是指在保持双歧杆菌能够增殖的程度的厌 氧度的密闭容器中，例如，可以例举在厌氧腔室或厌氧盒等中可能的条件。培养温度只要是 能够培养双歧杆菌的温度即可，通常为4°C~45°C，优选为15°C~40°C，更优选为24°C~ 37。。。
[0178] 此外，也可以制备不仅仅导入了使GLBP和目的蛋白质或肽的融合蛋白在表层提 呈的载体、还同时导入了使GLBP和具有佐剂功能的蛋白质的融合蛋白在表层提呈的载体 的转化双歧杆菌。
[0179]可以从转化双歧杆菌提取质粒，在限制酶处理后以电泳确认编码融合蛋白的基因 的导入，也可以将限制酶处理片段的序列进行直接测序。
[0180] 所得到的转化双歧杆菌的融合蛋白的表达的确认，例如，能够通过蛋白质印记法 进行。首先，例如，使用非离子性表面活性剂对转化双歧杆菌进行溶菌。作为非离子性表面 活性剂，可以列举聚氧乙烯脱水山梨醇酯（Tween (注册商标）20、40、60、65、80、85)、脱水山 梨醇酯（3?&11(注册商标）20、40、60、65、80、85)等。接着，使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、 硼酸缓冲液、三（羟基甲基）氨基甲烷（Tris)_盐酸缓冲液等进行稀释，使用十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)、三-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶等进行电泳。接着，转印到 硝基纤维素、聚偏氟乙烯（PVF)膜等，使针对目的蛋白质或肽的抗体（免疫球蛋白G(IgG)) 反应，接着使具有荧光标记的2次抗体反应，由此，能够确认融合蛋白的表达。
[0181] 特别是，目的免疫原性多肽在双歧杆菌表层提呈能够通过对转化双歧杆菌使用对 于目的蛋白质或肽的抗体和FITC标记抗IgG抗体的免疫抗体法来容易地确认。表层表达 免疫原性多肽的双歧杆菌的免疫原性能够通过粪便所含的抗原特异性IgA抗体（局部粘膜 免疫的诱导）、血清所含的抗原特异性IgG抗体（全身性免疫的诱导）、以及由抗原刺激得 到的细胞内细胞因子（例如，干扰素y(IFN-y))产生的诱导等来确定。
[0182] 确认了目的免疫原性多肽的表层提呈的转化双歧杆菌，通过本领域技术人员常用 的方法进行培养、回收，可以直接用于制剂的制造。或者，也可以干燥使用。干燥通过进行 冻干、低温干燥等低温处理，以暴露于肠内环境或培养基等培育条件下时能够培育的处理 方法进行。
[0183] 转化双歧杆菌可以用公知的方法进行后处理。例如，可以通过离心分离等进行粗 精制。另外，根据期望，进行粗精制后可以使其溶解或悬浮于生理盐水、磷酸缓冲生理盐水 (PBS)或乳酸配合林格氏液等的本领域一直使用的溶剂中。另外，也可以根据期望进行冻干 或喷雾干燥，形成为粉状物或粒状物。
[0184](含转化双歧杆菌的疫苗组合物）
[0185] 本发明的疫苗组合物中含有上述转化双歧杆菌作为有效成分。例如，在为表层表 达HCV免疫原性多肽的转化双歧杆菌的情况下，本发明的疫苗组合物能够以对HCV感染充 分诱导适当的免疫应答的量对患者给药。
[0186] 为了形成疫苗，转化双歧杆菌作为其活菌的冷冻、冻干、悬浮液或细胞糊、或者与 固体介质或凝胶或液状介质组合保存。作为给药制剂的剂型，没有限定，优选粉末、使该冻 干粉末悬浮的液剂、或封入该冻干粉末的胶囊剂等。作为胶囊剂，例如，可以适当使用专利 文献5所记载的耐酸性胶囊。给药通路没有特别限定，可以列举口服给药或非口服给药。优 选口服给药或者经鼻给药，更优选口服给药。
[0187] 作为适于口服给药的制剂的例子，例如，可以列举颗粒剂、细粒剂、散剂、糖浆剂、 溶液剂、胶囊剂或悬浊剂等。作为适于非口服给药的制剂的例子，例如，可以列举注射剂、点 滴剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。
[0188] 口服给药用的液体制剂的制造中，例如，能够使用水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖类； 聚乙二醇、聚丙二醇等二醇类；芝麻油、橄榄油、大豆油等油类；对羟基苯甲酸酯类等防腐 剂等制剂用添加物。另外，在胶囊剂、散剂或颗粒剂等固态制剂的制造中，例如，能够使用乳 糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；淀粉、海藻酸钠等崩解剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚 乙烯醇、羟丙纤维素、明胶等结合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂。
[0189] 非口服给药用的制剂中，注射剂、点滴剂等血管内给药用制剂能够优选使用与人 血液等渗的水性介质进行制备。例如，注射剂能够使用选自盐溶液、葡萄糖溶液、或盐溶液 和葡萄糖溶液的混合物的水性介质，根据常规方法与适当的助剂一起形成溶液、悬浊液或 分散液来制备。用于肠内给药的栓剂，例如，能够使用可可脂、氢化油脂或氢化脂肪酸等载 体来制备。
[0190] 非口服给药用的制剂中，喷雾剂能够使用不刺激人的口腔和气管粘膜、且能够将 作为有效成分的转化双歧杆菌作为微细的颗粒分散而促进吸收的载体来制备。作为这样的 载体，例如，能够使用乳糖或甘油等。根据转化双歧杆菌和所使用的载体的性质，能够作为 空气溶胶、干粉等的形态的制剂来制备。非口服给药用的制剂的制造中，例如，能够使用选 自稀释剂、香料、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、表面活性剂、增塑剂等的中1种 或2种以上的制剂用添加物。
[0191] 本发明的疫苗组合物内的转化双歧杆菌的含量可以根据制剂的种类或剂形、给药 对象的年龄、性別、体重或患病状态、给药或摄取的方法、时期或时间等适当设定。
[0192] 本发明的转化双歧杆菌，例如，免疫原性多肽为HCV抗原多肽（例如，NS3所来源的 抗原多肽）时，成为对HCV的感染有效的口服疫苗。含有本发明的免疫原性HCV抗原多肽 表层表达转化双歧杆菌的疫苗组合物可以用于HCV感染症的预防或治疗的任一种。另外， 本疫苗组合物也能够与现有的干扰素疗法等并用。
[0193] 本发明的转化双歧杆菌抑制表达NS3/4A的肿瘤细