液中加入1毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温 下搅拌48小时。反应结束后，反应液水层为亮黄色澄清液，氯仿层为浅黄色澄清溶液。将 反应液和脂肪酶分离，直接用质谱分别分析水相和氯仿相组成。不做HPLC纯化。
[0043]对反应液进行了质谱表征。氯仿相中发现很规整的几个信号峰，分子量为 483. 4, 724. 5和965. 7,分别对应相应的环肽；相反，水相中没有发现有环肽信号峰，如图3 所示。这可能是由于环肽的电中性使其在氯仿中有较好的溶解度，而带电（胺基和酶上的 氨基酸端基）的线性肽则更易于溶解在水相。
[0044] 实施例4
[0045] 氯仿相：在20毫升的小瓶中加入5毫升氯仿，通氩气十分钟除去水中的氧。然后 往溶液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，1毫摩尔的 异戊醛和1毫摩尔的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室温下搅拌15分钟。待反应液完全澄清 后，往反应液中加入1毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。
[0046] 形成的环肽结构和得率见表1，用质谱定量分析，氯仿相中环肽和直链肽共存，环 肽相对含量为25%。
[0047] 实施例5
[0048] 水相：在20毫升的小瓶中加入5毫升水，通氩气十分钟除去水中的氧。然后往溶 液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，1毫摩尔的异戊 醛和1毫摩尔的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室温下搅拌15分钟。待反应液完全澄清后，往 反应液中加入1毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。反应结束后，反应液 为乳白色悬浮液。
[0049] 将反应液和脂肪酶分离，旋蒸除去反应液的水并重新溶于甲醇。
[0050] 取出部分用ESI-MS和TOF-MS分析产物组成，并用HPLC进行纯化，具体结果如图 4所示，异戊醛、2, 2-二甲基-1，3-丙二胺和异腈乙酸乙酯在水相中的缩合反应得到了非常 纯的环肽，256. 2, 511. 4, 766. 6和1021. 8四个规整的离子信号峰分别对应相应分子量的环 肽，杂质离子峰很少。
[0051] 剩余部分在乙醚中沉淀、干燥得浅黄色固体粉末，然后用于MALDI-T0F的表征，如 图5所示，间隔255的多组峰表明产物是不同重复单元的多肽；1060与重复单元为3的相 应环肽的加钾分子量完全吻合，这些结果证明了水相酶催化Ugi三组分反应合成了不同分 子量的环肽。
[0052] 其中，HPLC纯化参数如下：
[0053]柱子型号：YMC-Pack0DS-AQ，4. 6*250mm，5ym;
[0054] 溶剂A:乙腈中加入体积浓度为0. 1%三氟乙酸；
[0055] 溶剂B:水中加入三氟乙酸，体积0. 1 % ;
[0056] 梯度： A B(体积比）
[0057] 0.0min-20.0 min 10% 90%
[0058] 20.0min-30.0 min 100% 0%；
[0059]溶剂流速：I.OmL/min;
[0060] 检测波长：220nm。
[0061] 形成的环肽结构和得率见表1，用质谱定量分析，水相几乎为环肽，环肽相对含量 为 95%。
[0062] 实施例6
[0063]水相：在20毫升的小瓶中加入5毫升水，通氩气十分钟除去水中的氧。然后往溶 液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，0.3毫摩尔的正 丁醛和0. 3毫摩尔的1，3-丙二胺，室温下搅拌15分钟。待反应液完全澄清后，往反应液中 加入0. 3毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。
[0064]反应结束后，形成的环肽结构和得率见表1，用质谱定量分析，水相中环肽和直链 肽共存，环肽相对含量为55%。
[0065] 实施例7
[0066]水相：在20毫升的小瓶中加入5毫升水，通氩气十分钟除去水中的氧。然后往溶 液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，2. 5毫摩尔的异 戊醛和2. 5毫摩尔的1，3-丙二胺，室温下搅拌15分钟。待反应液完全澄清后，往反应液中 加入2. 5毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。反应结束后，对反应液进行 了质谱表征，如图6所示。
[0067]异戊醛、1，3-丙二胺和异腈乙酸乙酯在水相中的缩合反应得到了非常纯的环肽， 256. 2, 511. 4, 766. 6和1021. 8四个规整的离子信号峰分别对应相应分子量的环肽，杂质离 子峰很少。
[0068] 形成的环肽结构和得率见表1，用质谱定量分析，水相中环肽和直链肽共存，环肽 相对含量为70%。
[0069] 实施例8
[0070]水相：在20毫升的小瓶中加入5毫升水，通氩气十分钟除去水中的氧。然后往溶 液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，1.5毫摩尔的正 丁醛和1. 5毫摩尔的4, 7, 10-三氧-1，13-十三烷二胺等二胺，室温下搅拌15分钟。待反 应液完全澄清后，往反应液中加入1. 5毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。 反应结束后，对反应液进行了质谱表征，如图7所示。
[0071] 形成的环肽结构和得率见表1，用质谱定量分析，水相中环肽和直链肽共存，环肽 相对含量为60%。
[0072] 实施例9
[0073] 有机溶剂分别选择：甲醇、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺。
[0074] 在20毫升的小瓶中加入5毫有机溶剂，通氩气十分钟除去有机溶剂中的氧。然后 往溶液中加入反应物（二胺、异腈、醛）总质量的20%的南极假丝酵母脂肪酶，1毫摩尔的 异戊醛和1毫摩尔的2, 2-二甲基-1，3-丙二胺，室温下搅拌15分钟。待反应液完全澄清 后，往反应液中加入1毫摩尔的异腈乙酸乙酯，反应液室温下搅拌48小时。
[0075] 酶催化Ugi三组分反应均不能发生，没有环肽生成。
[0076] 表1.酶催化Ugi三组分反应的实验结果（不同的二胺和醛）。
[0077]
【主权项】
1. 一种多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，包括在液相体系中，将二胺、异腈、醛 在酶的催化作用下发生反应，得到环肽。2. 根据权利要求1所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述二胺、异腈、 醛按摩尔比1 :1 :1进行反应。3. 根据权利要求1或2所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述液相体系 为水、氯仿中的一种或两种。4. 根据权利要求3所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述液相体系为 水。5. 根据权利要求1-4任一项所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，二胺、异 腈或醛在液相体系中的浓度分别为〇. 06~0. 5mol/L。6. 根据权利要求1-5任一项所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述酶 为脂肪酶。7. 根据权利要求6所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述脂肪酶为南 极假丝酵母脂肪酶。8. 根据权利要求1-7任一项所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述二 胺的胺基间碳原子数为3-13个，且溶于水。9. 根据权利要求1-8任一项所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述醛 为异戊醛或正丁醛。10. 根据权利要求1-9任一项所述的多组分反应合成环肽的方法，其特征在于，所述异 腈为异腈乙酸乙酯。
【专利摘要】本发明公开了一种酶催化多组分反应合成环肽的方法，所述方法，包括在液相体系中，将二胺、异腈、醛在酶的催化作用下发生反应，得到环肽。本发明的酶催化多组分反应合成环肽的方法，将二胺引入多组分反应，在酶的催化下通过分子间扩链和分子内成环制备含有不同数量的肽键单元的环肽；不需要其他的催化剂或者缩合剂，高效构建直链肽分子，并在原位诱导环化实现环肽的合成，尤其在有水的作用下，生成的环肽纯度高于95％。
【IPC分类】C12P21/04, C12P17/14
【公开号】CN105087709
【申请号】CN201510515980
【发明人】严骏杰, 杨敏, 潘栋辉, 徐宇平, 杨润琳, 王立振, 赵富宽, 张波
【申请人】江苏省原子医学研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月20日