一种灵芝醇b的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物化学领域，具体的说涉及一种灵芝醇B的制备方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝醇B为三萜类化合物，CAS号104700-96-1，分子式C3QH4S02，分子量440. 71，分 子结构式如下：
[0003]
[0004] 灵芝醇B是灵芝的次级代谢产物，具有多种生物活性的三萜类物质之一，已报道 的相关药理文献显示，灵芝醇B能抑制黑色素生成，减少雀斑，作为胆固醇合成的抑制剂， a-葡萄糖苷酶抑制剂，抑制前列腺癌细胞增长。
[0005] 现有的灵芝醇B的制备方法局限在柱层析法和色谱法，但这些方法具有耗时，制 备量小，存在死吸附的问题，开发适合工业化，大规模生产灵芝醇B的制备方法符合市场需 求，有现实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种灵芝醇B的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0007] (1)提取和富集灵芝醇B:将灵芝菌丝体加入90-99%乙醇溶液浸泡提取，提取液 浓缩；浓缩液依次分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取；将乙酸乙酯萃取液进行减压浓 缩，经正相硅胶（100-200目）柱层析，氯仿：甲醇=98:2-9:1依次洗脱，其中氯仿：甲醇 =98:2洗脱得到含有灵芝醇B的组分；
[0008] (2)高速逆流色谱法分离灵芝醇B:用高速逆流色谱仪对含有灵芝醇B的组分进行 分离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝醇B。
[0009] 具体的说，本发明的一种灵芝醇B的制备方法，包括如下步骤：
[0010] (1)提取和富集灵芝醇B:将灵芝菌丝体加入5-10倍体积的85-99%乙醇溶液常 温浸泡提取3-5次，每次40-60小时，然后将提取液浓缩；浓缩液依次分别用1-5倍体积的 石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行震荡萃取3-5次，每次静置2-8小时，将乙酸乙酯萃取液合并， 减压浓缩，经正相硅胶（100-200目）柱层析，用氯仿：甲醇=98:2-9:1依次洗脱，经薄层 色谱层析检测，合并类似组分，与灵芝醇B标准品对照后，发现氯仿：甲醇=98:2洗脱得到 含有灵芝醇B的组分；
[0011] (2)高速逆流色谱法分离灵芝醇B:溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成， 按11-15 :22-26 :16-22 :8-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，萃取物用下相 溶解并进样，转速700-900rmp，流速为l-3ml/min，每10~20mL收集为一个馏分；然后用高 效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，并与灵芝醇B标准品作对比，按不同成分收集、 浓缩、干燥，分离得到灵芝醇B。
[0012] 高速逆流色谱技术与传统的色谱技术相比是一种无固相载体的连续液_液分配 色谱技术，利用该种技术具有很多优势，不需固态支持物作载体、不存在不可逆吸附、样品 可以全部回收、分离时间短且分离效率高。此外，该技术操作简单灵活，在室温下进行，对不 稳定的样品也能有很好的分离效果，所用溶剂也可以回收，是一种经济有效获得灵芝中三 萜类化合物的方法。
[0013] 采用本发明的方法制备灵芝醇B，具有时间短、操作简单、成本低且得率高、纯度高 等优点。
【附图说明】：
[0014] 图1为实施例1的高速逆流分离谱图
[0015] 图2为实施例1中获得的灵芝醇B的高效液相谱图
[0016] 图3为实施例2的高速逆流分离谱图
[0017] 图4为实施例2中获得的灵芝醇B的高效液相谱图
【具体实施方式】
[0018] 供试菌株：沪农灵芝1号Ganodermalucidum由中国微生物菌种保藏管理委员会 农业微生物中心上海食用菌分中心提供，菌株编号：GanodermalucidumG0119。
[0019] 高速逆流色谱仪：购自上海同田生物技术股份有限公司，仪器型号为：TBE-300B。
[0020] 高效液相色谱仪：Waters公司产品，仪器型号为2695-717-600E。
[0021 ] 灵芝醇B标准品：购自国家标准物质标准样品信息中心。
[0022] 正相硅胶（100-200目）：青岛海洋化工厂；
[0023] 薄层层析（TLC)板（HSGF254):烟台汇友硅胶开发有限公司；
[0024] 其余试剂为普通市售产品。
[0025] 实施例1 :
[0026] 将培养于PDA平板上的灵芝菌丝体切成豌豆大小，接种于装有200mLBD培养基的 500mL三角瓶中，摇床培养（150r/min，26°C) 7d，制得一级种子液，然后把一级种子液按接 种量20%接到装有400mLBD培养基的1000mL三角瓶中，摇床培养（150r/min，26°C)3d制 得二级种子液，用来做此后的两阶段发酵。将二级种子液按接种量10%接种到400mlBD培 养基的l〇〇〇mL三角瓶中，在摇床培养（150r/min，26°C)3d，此为第一阶段的震荡培养。将 震荡培养的发酵液取下，静置在26°C、黑暗条件下培养14d，此为第二阶段的静置培养。
[0027] 取上述两阶段发酵的灵芝菌丝体8. 9kg，加入7倍体积的95 %乙醇水溶液常温浸 泡提取3次，每次48小时，然后将提取液减压浓缩；浓缩液依次分别加入2倍体积的石油 醚、氯仿、乙酸乙酯震荡萃取各3次，每次静置2小时。将乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩得 到固体萃取物50g，过硅胶柱（100-200目），用氯仿：甲醇=98:2-9:1依次洗脱，经薄层色 谱层析检测，合并类似组分，与灵芝醇B标准品对照后，发现氯仿：甲醇=98:2洗脱得到含 有灵芝醇B的组分，浓缩称重为4g。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按14:24:22:10的体积 比混合，充分分层后，取上相注满高速逆流色谱管做固定相，开转主机，转速850rpm/min，同 时栗入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品330mg，由进样阀进样，紫外检测 器在线监测，每l〇ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵芝醇B标准品作对 比，收集合并灵芝醇B的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得纯度为94%的灵芝 醇B15. 2mg。
[0028] 实施例2 :
[0029] 取两阶段发酵的灵芝菌丝体（发酵方法同实施例1)8. 9kg，加入7倍体积的95% 乙醇水溶液常温浸泡提取3次，每次48小时，然后将提取液减压浓缩；浓缩液依次分别加 入2倍体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯震荡萃取各3次，每次静置2小时。将乙酸乙酯萃取 液合并，减压浓缩得到固体萃取物50g，过硅胶柱（100-200目），用氯仿：甲醇=98:2-9:1 依次洗脱，经薄层色谱层析检测，合并类似组分，与灵芝醇B标准品对照后，发现氯仿：甲醇 =98:2洗脱得到含有灵芝醇B的组分，浓缩称重为4g。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水，按 12:24:20:10的体积比混合，充分分层后，取上相注满高速逆流色谱管做固定相，开转主机， 转速850rpm/min，同时栗入下相做流动相，流速为2ml/min，用流动相溶解样品150mg，由进 样阀进样，紫外检测器在线监测，每l〇ml收集为一个馏分。HPLC分析检测分离情况，并与灵 芝醇B标准品作对比，收集合并灵芝醇B的馏分，浓缩干燥，用高效液相面积归一化法测得 纯度为94%的灵芝醇B7.3mg。
【主权项】
1. 一种灵芝醇B的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： (1) 提取和富集灵芝醇B :将灵芝菌丝体加入90-99%乙醇溶液浸泡提取，提取液浓缩； 浓缩液依次分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取；将乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，经 正相硅胶100-200目柱层析，氯仿：甲醇=98:2-9:1依次洗脱，其中氯仿：甲醇=98:2洗 脱得到含有灵芝醇B的组分； (2) 高速逆流色谱法分离灵芝醇B :用高速逆流色谱仪对含有灵芝醇B的组分进行分 离；然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝醇B。2. 根据权利要求1所述的灵芝酸T的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： (1) 提取和富集灵芝醇B :将灵芝菌丝体加入5-10倍体积的85-99%乙醇溶液常温浸 泡提取3-5次，每次40-60小时，然后将提取液浓缩；浓缩液依次分别用1-5倍体积的石油 醚、氯仿、乙酸乙酯进行震荡萃取3-5次，每次静置2-8小时，将乙酸乙酯萃取液合并，减压 浓缩，经正相硅胶100-200目柱层析，用氯仿：甲醇=98:2-9:1依次洗脱，经薄层色谱层析 检测，合并类似组分，与灵芝醇B标准品对照后，发现氯仿：甲醇=98:2洗脱得到含有灵芝 醇B的组分； (2) 高速逆流色谱法分离灵芝醇B :溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，按 11-15 :22-26 :16-22 :8-11体积比混合，取上相做固定相，下相为流动相，萃取物用下相溶 解并进样，转速700-900rmp，流速为l-3ml/min，每10~20mL收集为一个馏分；然后用高效 液相色谱法分析检测各试管收集液成分，并与灵芝醇B标准品作对比，按不同成分收集、浓 缩、干燥，分离得到灵芝醇B。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝醇B的制备方法，该方法包括步骤；(1)提取和富集灵芝醇B；(2)高速逆流色谱法分离灵芝醇B。本发明的一种灵芝醇B的制备方法操作简单，污染小，成本低，灵芝醇B的得率、纯度高。
【IPC分类】C07J9/00
【公开号】CN105111267
【申请号】CN201510650324
【发明人】冯娜, 张劲松, 冯杰, 魏雨恬, 田振
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年10月9日