。样品可以含有 完整的细胞，可以是未经加工的或澄清的细胞裂解液或者可以包含经纯化的酶，所述酶产 生或使用ATP。所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。
[0065] 本文所公开的组合物和试剂盒可以用于测定样品中荧光素酶的存在和量。在转染 例如荧光素酶基因，例如报告基因的瞬时或稳定转染后，样品中可以存在荧光素酶。所述样 品可以含有完整的细胞，未加工的或澄清的细胞裂解液或包含整个动物，例如对整个动物 成像。在无细胞提取物中表达荧光素酶编码序列例如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽翻译 系统后，样品中可以存在荧光素酶。所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。
[0066] 但是应当理解，在其申请中本发明并不限于在描述中所列或以下附图中所示的结 构细节和组分排列。本发明能够实施其它实施方案，且能够以各种方式实施或进行。
[0067] 应当理解，在说明书中叙述的任何数值范围包括从下限值到上限值的所有值。例 如，如果浓度范围描述为1 %至5 0 %，则意图是，在该说明中明确例举了例如2 %至4 0 %、 10 %至30 %或1 %至3 %等的值。应当理解，在说明书中引述的任何数值范围包括从至少所 述下限值（不含上限）的所有值，和高至所述上限值（不含下限）的所有值。这些仅是具 体意图的例子，并且在列举的最小值和最大值之间且包括所述最小值和最大值的所有可能 的数值组合被视为在本申请中明确地说明。
[0068] 但是应当理解，在其申请中本发明并不限于在描述中所列的结构细节和组分排 列。此外，应当理解，本说明书中使用的措辞和术语是为了描述的目的，且不应被视为限制 目的。在描述本发明的上下文中术语"一个"和"一种"以及"所述"和类似指示物将被解释 为涵盖单数和复数形式，除非本说明书中另有说明或上下文中明显矛盾。术语"包含"、"具 有"、"包括"和"含有"将被解释为开放式术语（即，意味着"包括但不限于"），除非另有说 明。除非在本说明书中另有说明或上下文中另有明显矛盾，否则可以以任何合适的顺序进 行本说明书中所述的所有方法。本文引述的专利申请、专利和引用文献明确地且完全地通 过引入整体并入。在不一致的解释是可能的情况下，以本公开内容为准。
[0069] 本文提供的任何和所有的实施例或示例性语言（例如，"如"）的用途仅意图说明 本公开的内容和实施方案，而不限制权利要求的范围。
[0070] 实施例1 :加速的稳定性
[0071] 将5mM L-荧光素溶解于CelITiter-Glo (含有Ultra-Glo荧光素酶和5mM D-荧 光素的ATP检测试剂；Promega Corporation)。将等分试样在不同温度下放置不同长度的 时间，然后储存在_80°C。所有的样品同时解冻到室温，然后与I y M于水中的ATP以1:1混 合。10分钟后测量发光度（RLU)。结果于图1所示。
[0072] 从较高温度下的衰变率，使用阿伦尼乌斯方程来计算较低温度下的衰变率。在 22°C，计算10%性能损失在8. 6天时发生。在4°C，计算10%和50%损失分别在4. 2个月 和2年时发生。在-20°C，计算10%的损失在20年时发生。
[0073] 实施例2 :在22°C的实时稳定性。
[0074] 将具有和不具有5mM L-荧光素的CellTiter-Glo的等分试样在22°C放置不同长 度的时间，然后储存在_80°C。所有的样品同时解冻到室温，然后与IyM于水中的ATP以 1:1混合。10分钟后测量发光度（RLU)。结果于图2所示。
[0075] 对于不具有和具有L-荧光素的CellTiter-Glo,在22°C，10%性能变化分别在约 12小时或约2周时发生。
[0076] 实施例3-荧光素和5'-氟荧光素的比较
[0077] 将5mM L-异构体焚光素或氟焚光素溶解于包含5mM各自的D-异构体的试剂 (500禮1^5，卩册，40011111((：1、31111〇^^、2011111%504、21111恥卩、151^焦磷酸四钠、2% Thesit，l% DTAB、0. 2% Mazu 和 0.21mg/ml Ultra-Glo)中。然后，包括 CellTiter-Glo 的 每种试剂与2 y M于水中的ATP以1:1混合，且测量随着时间推移的发光度（RLU)。结果于 表1所示。
[0078] 表 1
[0079]
[0080] 尽管当比较D-异构体时在光输出方面仅存在适度差异，但是5'-氟荧光素的异 构体混合物比具有大致相同的信号半衰期的荧光素的异构体混合物显著明亮。
[0081] 实施例4.含有天然萤火虫荧光素酶的试剂的增加的稳定性
[0082] 将ImM L-荧光素溶解于包含ImM D-荧光素和13. 54 y g/ml天然萤火虫荧光素酶 的试剂（50mM乙酸镁、25mM Tris 乙酸，pH 7. 75,0.1 mM EDTA、0. 002%叠氮化物、0? 5mM DIT、 1.3mg/ml BSA) (QuailtiLum ?重组焚光素酶，Promega，Madison WI)。将等分试样在 22°C 下放置不同长度的时间，然后储存在_80°C。所有的样品同时解冻到室温，然后通过注射与 20nM于水中的ATP以1:1混合。10秒延迟之后，测量发光度（RLU)并在10秒钟内求积分。 结果于表3所示。
[0083]对于不具有或具有L-荧光素的试剂，在22°C，10%的性能变化分别在约5小时或 约50小时时发生。
[0084] 实施例5.荧光素酶报告基因测定试剂中不同的D-/L-荧光素比率对发光度和信 号半衰期的影响
[0085] 将稳定表达萤火虫荧光素酶（CMV-Fluc)的HEK293细胞在100 y 1完全培养基 (DMEM+10 %胎牛血清+1 X NEAA (非必需氨基酸））中的2. 5x10s个细胞/ml铺板于白色96 孔板中。然后将所述细胞在37°C，5%C(Vf孵育过夜。过夜孵育后，使平板平衡到22°C。 将含有ImM荧光素的IOOy 1萤火虫荧光素酶报告基因测定试剂（其中D-5'-氟荧光素/ 1^-5'-氟荧光素为100:0、95 :5、90:10、85:15、80:20 或 75:25)添加到细胞中（11 = 3)，并 且在搅拌下孵育3分钟。在GloMax? Multi+上在22°C每3分钟测量发光度，持续5小 时。
[0086] 图4显示了不同的D-/L-荧光素比率对初始发光度（RLU) (A)和信号半衰期（B) 的影响。通过将发光度与单指数衰减拟合来计算信号半衰期。
[0087] 实施例6.不同的D-/L-荧光素比率对荧光素酶报告基因测定试剂的稳定性的影 响
[0088] 制备具有不同比率（100:0、90 :10、80:20、70:30、60:40和50:50)的0-/1-5'-氟 荧光素的萤火虫荧光素酶报告基因测定试剂。将每种试剂分成180 y 1等分试样并在22°C 水浴中孵育不同时间量（〇、1、2、3、4或5天）。每个时间段后，将每个比率的试剂的等分试样 在-80°C冷冻。时间进程结束之后，将所有等分试样解冻，通过上下吸打来混合，并将50 y 1 转移到96孔板的一式三份孔中，然后在22°C平衡。在补充有0. 1% Prionex的DMEM中将 纯化的萤火虫焚光素（QuantiLum)稀释到0. 69 y g/ml且向每孔添加50 y 1，并混合3分钟。 在GloMax? Multi+光度计上读取发光度。
[0089] 图5显示了当D-/L-5'氟荧光素的比率接近50:50时荧光素酶报告基因测定试剂 的室温稳定性增加。
【主权项】
1. 一种组合物，其包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素，其中所述组合物基本上不含 ATP02. -种组合物，其包含D-荧光素、L-荧光素和ATP，其中所述组合物基本上不含荧光 素酶3. -种组合物，其包含D-荧光素、L-荧光素和ATP，其中所述L-荧光素的浓度超过所 述D-荧光素的浓度。4. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物包含至少约0. 5:1至约2:1的 L-荧光素与D-荧光素的比率。5. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物包含至少约5:95至约55:45的 L-荧光素与D-荧光素的比率。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有至少约5且小于 约9的pH。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述荧光素酶是甲虫荧光素酶，如 萤火虫荧光素酶。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述D-荧光素是D-5'氟荧光素， 且所述L-荧光素是L-5'氟荧光素。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选 自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸 盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶A、还原剂或其组合。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物包含硫酸镁和反式-1，2-环己二胺 四乙酸（CDTA)。11. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选 自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、1，2-二氨基环己烧四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu 消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。12. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自 如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、 乙二胺四乙酸（H)TA)和AMP。13. 根据权利要求9、11或12所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的至 少两种。14. 根据权利要求9、11或12所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的至 少三种。15. 根据权利要求9、11或12所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的至 少四种。16. 根据权利要求9、11或12所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的至 少五种。17. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含镁离子、柠檬 酸缓冲剂、MES缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸 盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸（EDTA)。18. 根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含柠檬酸缓冲剂、 HEPES缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸（EDTA)、磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、羟基聚 乙氧基十二烷和AMP。19. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述甲虫荧光素酶是萤火虫荧光素酶或叩头 虫荧光素酶。20. 根据前述任一项权利要求所述的组合物，其中与基本上不具有L-荧光素的组合物 相比，当在约〇°C至约35°C的温度下储存时，所述组合物具有增加的储存寿命和/或稳定 性。21. -种组合物，其具有增加的储存寿命和/或稳定性，所述组合物包含荧光素酶、 L-荧光素和D-荧光素，其中所述组合物基本上不含ATP。22. 根据权利要求21所述的组合物，其中所述荧光素酶是甲虫荧光素酶。23. 根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述甲虫荧光素酶是萤火虫荧光素酶或 叩头虫荧光素酶。24. -种组合物，其具有增加的储存寿命和/或稳定性，所述组合物包含D-荧光素、 L-荧光素和ATP，其中所述组合物基本上不含荧光素酶。25. 根据权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少约0. 5:1至 约2:1的L-荧光素与D-荧光素的比率。26. 根据权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少约5:95至 约55:45的L-荧光素与D-荧光素的比率。27. -种组合物，其具有增加的储存寿命和/或稳定性，所述组合物包含D-荧光素、 L-荧光素和ATP，其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。28. 根据权利要求21至27中任一项所述的组合物，其中与基本上不具有L-荧光素的 组合物相比，当在约〇°C至约35°C的温度下储存时，所述反应混合物具有增加的储存寿命 和/或稳定性出现。29. 根据权利要求21至28中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有至少约5且小 于约9的pH。30. 根据权利要求21至29中任一项所述的组合物，其中所述D-荧光素是D-5'氟荧光 素，且所述L-荧光素是L-5'氟荧光素。31. 根据权利要求21至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选 自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸 盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶A、还原剂或其组合。32. 根据权利要求31所述的组合物，其中所述组合物包含硫酸镁和反式-1，2-环己二 胺四乙酸（⑶TA)。33. 根