据权利要求21至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选 自如下的额外组分：1，4-哌嗪二乙磺酸、1，2-二氨基环己烧四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu 消泡剂、硫酸镁、ATP、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。34. 根据权利要求21至33中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选 自如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸 钾、乙二胺四乙酸（H)TA)和AMP。35. 根据权利要求31、33或34所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的 至少两种。36. 根据权利要求31、33或34所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的 至少三种。37. 根据权利要求31、33或34所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的 至少四种。38. 根据权利要求31、33或34所述的组合物，其中所述组合物包含所述额外组分中的 至少五种。39. 根据权利要求21至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含镁离子、柠 檬酸缓冲剂、MES缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸 盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸（EDTA)。40. 根据权利要求21至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含柠檬酸缓冲 剂、HEPES缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸（EDTA)、磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、羟基 聚乙氧基十二烷和AMP。41. 一种试剂盒，其包含包装在至少一个容器中的如权利要求1至40中任一项所述的 组合物。42. -种试剂盒，其包含包装在第一容器中的如权利要求1至8和19至30中任一项所 述的组合物和第二容器，所述第二容器包含至少一种选自如下的组分：柠檬酸缓冲剂、MES 缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、乙二 胺四乙酸（EDTA)和AMP。43. 根据权利要求41或42所述的试剂盒，其中与基本上不具有L-荧光素的组合物相 比，当在约〇°C至约35°C之间的温度下储存时，所述组合物具有增加的储存寿命和/或稳定 性。44. 一种用于测定样品中ATP的存在或量的方法，其包括使如权利要求1、4至17、19至 23、25、26和28-39中任一项所述的组合物与样品接触以及检测所产生的发光度，由此测定 所述样品中ATP的存在或量。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述样品包括完整的细胞。46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述样品包括未加工的细胞裂解物或澄清的细 胞裂解物。47. 根据权利要求45或46所述的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。48. 根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述样品包含经纯化的酶，所述 酶产生或使用ATP。49. 根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中与基本上不具有L-荧光素的组 合物相比，当在约〇°C至约35°C之间的温度下储存时，所述组合物具有增加的储存寿命和/ 或稳定性。50. -种用于检测表达荧光素酶的细胞中荧光素酶活性的方法，所述方法包括在细胞 中表达荧光素酶；使所述荧光素酶、所述细胞或其组合与包含L-荧光素和D-荧光素的混 合物接触以及检测发光度，所述L-荧光素和所述D-荧光素的比率为（i)至少约5:95至约 75:25，（ii)至少约5:95至约50:50，（iii)至少约5:95至约25:75或（iv)至少约5:95 至约20:80。51. 根据权利要求50所述的方法，其中使所述细胞裂解，以及使包含所述荧光素酶的 所述裂解的细胞与所述混合物接触。52. 根据权利要求51所述的方法，其中使所述裂解的细胞澄清以形成包含所述荧光素 酶的澄清的细胞提取物，以及使所述澄清的细胞提取物与所述混合物接触。53. 根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞，如哺乳动 物细胞。54. 根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述混合物增加所述发光信号的 半衰期。55. 根据权利要求50至54中任一项所述的方法，其中用荧光素酶编码序列瞬时转染所 述细胞。56. 根据权利要求50至55中任一项所述的方法，其中所述混合物具有至少约6. 5至小 于约7. 8的pH或至少约6. 6至至少约6. 8的pH。57. 根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中所述D-荧光素是D-5'氟荧光 素，且所述L-荧光素是L-5'氟荧光素。58. 根据权利要求50至57中任一项所述的方法，其中与基本上不具有L-荧光素的组 合物相比，当在约〇°C至约35°C之间的温度下储存时，所述组合物具有增加的储存寿命和/ 或稳定性。59. -种用于进行荧光素酶反应的方法，所述方法包括： (a) 将包含L-荧光素和D-荧光素的混合物在约0°C至约35°C之间的温度下储存至少 约4小时的时间段，其中当在包含荧光素酶和ATP的测定物中与样品合并时，所述储存的混 合物允许产生光输出，并且其中所述时间段之后的所述光输出为所述时间段开始时的所述 光输出的至少约50% ;以及 (b) 在步骤（a)之后，允许所述储存的混合物与（i)所述样品和（ii)ATP或ATP源、荧 光素酶或其组合合并以形成反应测定物，以及检测所产生的发光度。60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述时间段为至少约12小时，且所述温度为约 0°C至约6°C或约20°C至约35°C。61. 根据权利要求59或60所述的方法，其中所述样品包含荧光素酶，且所述混合物包 含 ATP062. 根据权利要求59或60所述的方法，其中所述样品包含ATP，且所述混合物包含荧 光素酶。63. 根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约75%。64. -种用于配制用于荧光素酶反应的组分的方法，所述方法包括： (a) 将D-荧光素和L-荧光素合并以形成混合物；以及 (b) 将所述混合物在约0°C至约35°C的温度下储存至少约2天的时间段， 其中，当在包含荧光素酶的测定物中与样品合并时，所述混合物允许产生光输出，并且 其中所述时间段后的所述光输出为所述时间段开始时的所述光输出的至少约50%。65. 根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述混合物基本上不含ATP或荧 光素酶。66. 根据权利要求59至65中任一项所述的方法，其中所述温度为约20°C至约35°C。67. 根据权利要求59至66所述的方法，其中所述温度为约(TC至约6°C，且所述时间段 为至少约2周。68. 根据权利要求59至67中任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约12周。69. 根据权利要求59至68中任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约26周。70. 根据权利要求59至69中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约90%。71. 根据权利要求59至70中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约50%。72. 根据权利要求64至71中任一项所述的方法，其还包括在步骤（b)之后，将所述储 存的混合物与（i)荧光素酶、（ii) ATP或ATP源或（iii)其组合合并以形成第二混合物，以 及检测所述第二混合物中所产生的发光度。73. 根据权利要求50至55或57至72中任一项所述的方法，其中所述混合物具有约5 至约9的pH。74. 根据权利要求59至73中任一项所述的方法，其中所述混合物包含至少约5:95至 约75:25的L-荧光素与D-荧光素的比率。75. -种用于增加发光信号的半衰期的方法，所述方法包括： (a) 使包含荧光素酶的样品与包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的混合物接触以形成反 应测定物；以及 (b) 检测发光度；其中与包含D-荧光素且基本上无L-荧光素的可比较的反应测定物 相比，所述发光信号的半衰期增加。76. 根据权利要求75所述的方法，其中所述发光信号的半衰期增加了至少约25%。77. 根据权利要求75所述的方法，其中所述发光信号的半衰期增加了至少约5倍。78. 根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其中所述样品包括表达所述荧光素酶 的细胞。79. 根据权利要求78所述的方法，其中使所述细胞裂解，并且样品包括包含所述荧光 素酶的所述裂解的细胞。80. 根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其中样品包含含有所述荧光素酶的澄 清的细胞提取物。81. 根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细 胞。82. 根据权利要求75至81中任一项所述的方法，其中所述D-荧光素是D-5'氟荧光 素，所述L-荧光素是L-5'氟荧光素，并且其中所述可比较的反应测定物包含D-5'氟荧光 素并且基本上无L-5'氟荧光素。83. -种用于进行荧光素酶反应的方法，所述方法包括： (a) 使组合物与样品和ATP或ATP源、荧光素酶或其组合物合并以形成反应测定物，所 述组合物包含L-荧光素和D-荧光素；以及 (b) 检测所产生的发光度， 其中，与基本上不具有L-荧光素的组合物相比，如果所述组合物在约0°C至约35°C的 温度下储存至少4小时的时间段，则所述组合物具有增加的稳定性，其中当在包含荧光素 酶和ATP的测定物中与所述样品合并时，所述储存的混合物允许产生光输出，并且其中所 述时间段之后的所述光输出为所述时间段开始时的所述光输出的至少约50%。84. 根据权利要求83所述的方法，其中增加的稳定性包括增加的储存寿命和/或增加 的信号稳定性。85. 根据权利要求83或84所述的方法，其中所述时间段为至少约12小时，且所述温度 为约(TC至约6°C或约20°C至约35°C。86. 根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述样品包含荧光素酶，且所述 组合物包含ATP。87. 根据权利要求83至85所述的方法，其中所述样品包含ATP，且所述组合物包含荧 光素酶。88. 根据权利要求83至87中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约75%。89. -种用于配制用于荧光素酶反应的组分的方法，所述方法包括将D-荧光素和L-荧 光素合并以形成组合物，其中与基本上不具有L-荧光素的组合物相比，如果所述组合物在 约0°C至约35°C的温度下储存至少4小时的时间段，则所述组合物具有增加的稳定性，其 中当在包含荧光素酶和ATP的测定物中与所述样品合并时，所述储存的组合物允许产生光 输出，并且其中所述时间段之后的所述光输出为所述时间段开始时的所述光输出的至少约 50%〇90. 根据权利要求89所述的方法，其中增加的稳定性包括增加的储存寿命和/或增加 的信号稳定性。91. 根据权利要求83至90中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上不含ATP或荧 光素酶。92. 根据权利要求83至91中任一项所述的方法，其中所述温度为约20°C至约35°C。93. 根据权利要求83至92中任一项所述的方法，其中所述温度为约0°C至约6°C，且所 述时间段为至少约2周。94. 根据权利要求83至93中任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约12周。95. 根据权利要求83至94中任一项所述的方法，其中所述时间段为至少约26周。96. 根据权利要求83至95中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约90%。97. 根据权利要求83至96中任一项所述的方法，其中所述时间段之后的所述光输出为 所述时间段开始时的所述光输出的至少约50%。98. 根据权利要求83至97中任一项所述的方法，其还包括在步骤（b)之后，将所述组 合物与（i)荧光素酶、（ii) ATP或ATP源或（iii)其组合合并以形成混合物，以及检测所述 混合物中所产生的发光度。99. 根据权利要求83至98中任一项所述的方法，其中所述组合物具有约5至约9的 pH〇100. 根据权利要求83至99中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少约5:95至 约75:25的L-荧光素与D-荧光素的比率。
【专利摘要】本发明公开了含有用于产生光的D-荧光素和L-荧光素以及荧光素酶的混合物的方法、试剂盒和组合物，当随时间流逝储存时，所述组合物具有改善的稳定性。D-荧光素和L-荧光素的混合物可以用来检测样品中的ATP或者荧光素酶的存在或量。
【IPC分类】C12Q1/66
【公开号】CN105121653
【申请号】CN201480010140
【发明人】迈克尔·P·瓦利, 詹姆士·J·卡利, 布洛克·宾考斯基, 克里斯多弗·托德·艾格斯, 基思·V·伍德
【申请人】普洛麦格公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年2月21日
【公告号】EP2959010A1, US20140242627, WO2014130760A1