多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用图
【专利说明】多次甲基化合物和其作为黄光标巧物的用途
[0001] 本公开内容设及新的多次甲基化合物和其作为巧光标记物的用途。特别地，化合 物可W在核酸测序应用中被用作用于核巧酸的巧光标记物。 柳〇引背景
[0003] 在本申请中引用若干出版物和专利文献，W便更充分地描述本公开内容所属的领 域的状态。运些出版物和文献中的每个的公开内容通过引用并入本文。
[0004] 利用巧光标记物的核酸的非放射性检测在分子生物学中是重要的技术。在重组 DNA技术中采用的许多程序之前主要依赖于用例如32P放射性地标记的核巧酸或多核巧酸 的使用。放射性化合物允许灵敏检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的 使用中存在严重的限制，诸如其费用、有限的储存期W及更重要地安全考虑。排除对放射性 标记物的需求提高安全性，同时减少与例如试剂处置相关的环境影响和成本。通过非限制 性实例的方式，适合于非放射性巧光检测的方法包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应 产物的实时检测和免疫测定。 阳0化]对于许多应用，期望采用多重光谱可区别的巧光标记物W便实现多个空间上重叠 的分析物的独立检测。在运类多重方法中，反应容器的数目可W减少，从而简化实验方案并 且有利于产生应用特定的试剂盒。例如，在多色自动DNA测序中，多重巧光检测允许在单个 电泳泳道中分析多个核巧酸碱基，从而使总处理能力（throu曲put)增加超过单色方法并 且降低与泳道之间的电泳迁移率变化相关的不确定性。
[0006] 然而，多重巧光检测可W是有问题的并且有限制巧光标记物的选择的许多重要因 素。首先，可能难W发现发射光谱在给定的应用中被适当地光谱地分辨的染料化合物。此 夕F，当若干巧光染料被一起使用时，通过同时激发在可区别的光谱区中产生巧光信号可能 是困难的，因为对此可W是可用的染料的吸收带通常被宽泛地分开，所W难W实现几乎相 等的巧光激发效率（甚至对于两种染料）。许多激发方法使用高功率光源，如激光并且因此 染料必须具有足够的光稳定性W经受运种激发。分子生物学方法中特别重要的最终考虑是 巧光染料必须与使用的试剂化学成分诸如例如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连 接酶相容的程度。
[0007] 随着测序技术提高，需要开发另外的巧光染料化合物、其核酸缀合物W及满足W 上限制中的全部并且特别适合于高总处理能力的分子方法诸如固相测序W及类似方法的 染料组。
[0008] 具有改进的巧光性质诸如巧光带的巧光强度、形状和最大波长的巧光染料分子可 W改进核酸测序的速度和精确度。当在基于水的生物缓冲液中并且在较高溫度下进行测量 时，强巧光信号是特别重要的，因为大部分染料的巧光强度在运类条件下是显著较低的。此 夕F，染料被附接到其的碱基的性质也影响最大巧光、巧光强度和其他光谱染料性质。核碱基 (mucleobase)和巧光染料之间的序列特定的相互作用可W通过巧光染料的特定设计来调 整。巧光染料的结构的优化可W改进核巧酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核 酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。
[0009] 本文描述改进的多次甲基构建体和其作为生物分子标记物、特别地作为用于在核 酸测序中使用的核巧酸的标记物的用途。可W看到在使用新的巧光构建体可获得的标记的 核巧酸并入的效率和测序读数的长度上的具体改进。
[0010] 概述
[0011] 根据第一方面，本公开内容提供式（I)的多次甲基染料化合物或其内消旋形式：
[0012]
巧
[0013] 其中mCat+或HiAn是有机或无机的带正电荷/带负电荷的反离子，并且
[0014] m是整数0-3; 阳〇1引Ra郝Raz中的每个独立地是H、S03、横酷胺、面素、或稠合至相邻碳原子的另外的 环；
[0016] 化是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；
[0017] RCi和Rc2中的每个独立地是烷基或被取代的烷基；并且
[0018] 化、或RCi或Rc2中的一个包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接 至另外的分子。
[0019] 在另一个实施方案中，本公开内容的化合物可W与多种底物部分诸如例如核巧、 核巧酸、多核巧酸、多肤、碳水化合物、配体、颗粒、细胞、半固体表面（例如凝胶）和固体表 面缀合。
[0020] 因此，根据本公开内容的另外的方面，提供了包含连接基的染料化合物，该连接基 使得能够实现例如共价附接至运类底物部分。
[0021] 根据另外的方面，本公开内容提供通过式：NA-染料定义的核巧或核巧酸化合 物，其中N是核巧酸，L是任选的连接基部分并且染料是根据本公开内容的巧光化合物。
[0022] 在另外的方面中，本公开内容提供使用本公开内容的染料化合物测序的方法。
[0023] 根据另外的方面，本公开内容还提供包含染料化合物（游离的或呈缀合物的形 式）的试剂盒，该试剂盒可W用于各种免疫测定、寡核巧酸与核酸标记W及用于通过合成 的DNA测序。在又另一方面中，本公开内容提供包含染料'组'的试剂盒，该试剂盒特别适 合于在自动仪器平台上进行通过合成的测序循环。
[0024] 本公开内容的另外的方面是本公开内容的化合物的化学制备。 阳〇2引详细描述
[00%] 本公开内容提供新颖的多次甲基染料化合物，其特别适合于巧光检测和通过合成 测序的方法。
[0027]根据第一方面，本公开内容提供式（I)的多次甲基染料化合物或其内消旋形式：
[0028]
(I)
[0029] 其中mCat+或mAn-是有机或无机的带正电荷/带负电荷的反离子，并且
[0030] m是整数0-3 ; 阳0川 Ra郝Ra2中的每个独立地是H、SO3、横酷胺、面素、或稠合至相邻碳原子的另外的 环；
[0032] 化是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基；
[0033] Rci和Rc2中的每个独立地是烷基或被取代的烷基；并且
[0034] 化、或RCi或Rc2中的一个包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接 至另外的分子。 阳0对每个Rai或Raz可W独立地是H、S〇3、横酷胺、面素、或稠合至相邻碳原子的另外 的环；Rai或Ra巧W是H。Rai或Ra巧W是SO 3。Ra河W与Ra 2不同，例如，结构在Rai处 可W具有单个横酸基，并且H作为Raz。Rai或Ra2可W是横酷胺。横酷胺可W是SO2NH2或 SOzNHR,其中R是烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基。
[0036] Rai或Ra2可W是稠合至吗I噪环的相邻碳的另外的脂肪族环、芳香族环或杂环。例 如，在运类情况下，当芳香族环被稠合时，染料端基可W代表W下类型的结构。
[0037]
[0038] 因此，本公开内容的染料可W通过式（IA)、（IB)或（IC)来描述：
[0039]
(IA)
(IB)
[0040]
任均
[0041] 在式（IA)、（IB)或（IC)中，稠合至吗I噪环的相邻碳原子的一个或两个另外的环可 W任选地例如被横酸或横酷胺取代。
[0042] 化合物可W是，其中Ra基团中的一个是形成式（II)的结构的另外的稠合的环：
[0043]
抑 W44] 其中Ras是H、so3、横酷胺或面素；并且 W45] Rci是烷基或被取代的烷基。
[0046] 化可W是任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基。化可W是烷基。化可W 是甲基、乙基、丙基、下基、戊基或己基。烷基链可W例如用簇基或横酸基进一步取代。化可 W用于进一步缀合。例如，如果化包含COOH部分，其可W与另外的分子缀合W便附接标记 物。在生物分子、蛋白质、DNA标记化及诸如此类的情况下，缀合可W经由化来实施。在缀 合已经发生之后，化可W形成酷胺或醋衍生物。化合物可W经由化附接至核巧酸或寡核 巧酸。
[0047] 化可W是芳基或被取代的芳基。化可W是苯基。
[0048] 每个Rci和Rc2可W独立地是烷基或被取代的烷基。Rc1和Rc2可W是甲基、乙基、 丙基、下基、戊基、己基或（C肥)qS03H，其中q是l-6。q可W是l-3。RCl和Rc2可W是被取 代的烷基。Rci和Rc2可W包含COOH或-SOsH部分或其醋或酷胺衍生物。
[0049] 化或RCi或Rc2包含用于进一步附接至另外的分子的连接部分或被连接至另外的 分子。化或Rci或Rc2可W包含簇基或簇酸根（COOH或COO)部分。在缀合已经发生之后， 化或Rci或Rc2可W包含酷胺或醋。
[0050] 化合物的实例包括：
[0051]
[0052] 阳〇5引或其盐。
[0054] 特别有用的化合物是如本文描述的用染料标记的核巧酸或寡核巧酸。标记的核巧 酸或寡核巧酸可W具有经由被取代的烷基化或RCi或Rc2附接的标记物。标记的核巧酸或 寡核巧酸可W具有通过连接基部分附接至喀晚碱基的巧位或7-脱氮嚷岭碱基的C7位的 标记物。 阳化5] 标记的核巧酸或寡核巧酸还可W具有共价地附接至核巧酸的核糖或脱氧核糖的 阻断基团。阻断基团可W在核糖或脱氧核糖的任何位置处被附接。在特定的实施方案中， 阻断基团在核巧酸的核糖或脱氧核糖的3' OH位。
[0056]本文提供了包含两种或更多种核巧酸的试剂盒，其中至少一种核巧酸是用本公开 内容的化合物标记的核巧酸。试剂盒可W包含两种或更多种标记的核巧酸。核巧酸可W用 两种或更多种巧光标记物来标记。标记物中的两种或更多种可W使用单个激发源来激发， 所述单个激发源可W是激光。例如，两种或更多种标记物的激发带可W是至少部分重叠的， 使得在光谱的重叠区中的激发引起两种标记物均发射巧光。在特定的实施方案中，来自两 种或更多种标记物的发射将在光谱的不同区域中发生，使得标记物中的至少一种的存在可 W通过光学地区别该发射而确定。
[0057]试剂盒可W包含四种标记的核巧酸，其中四种核巧酸中的第一核巧酸用如本文公 开的化合物标记。在运种试剂盒中，第二核巧酸、第=核巧酸和第四核巧酸可W各自用任选 地不同于第一核巧酸上的标记物且任选地不同于彼此的标记物的化合物标记。因此，化合 物中的一种或更多种可W具有不同的最大吸收度和/或最大发射，使得该化合物与其他化 合物是可区别的。例如，每种化合物可W具有不同的最大吸收度和/或最大发射，使得化合 物中的每种与其他=种化合物是可区别的。将理解的是，除了最大值之外的吸收光谱和/ 或发射光谱的部分可W不同，并且运些差异可W被利用W区别化合物。试剂盒可W使得化 合物中的两种或更多种具有在600nmW上的不同的最大吸收度。
[0058]本文陈述的化合物、核巧酸或试剂盒可W被用于检测、测量或识别生物系统（包 括，例如其过程或其组分）。可W采用化合物、核巧酸或试剂盒的示例性技术包括测序、表达 分析、杂交分析、基因分析、RNA分析、细胞测定（例如，细胞结合或细胞功能分析）或蛋白 质测定（例如，蛋白质结合测定或蛋白质活性测定）。用途可W是在用于实施特定技术的自 动仪器上进行，诸如自动测序仪器。测序仪器可W包含在不同的波长下操作的两种激光。 阳059] 本文公开合成本公开内容的化合物的方法。式狂）和/或式狂1)、式狂2)的化合 物或其盐可W被用作用于合成对称的或不对称的多次甲基染料的起始物料：
[0060]
阳06U其中Ra是H、S03、横酷胺、面素、或稠合至相邻碳原子的另外的