一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物病毒学领域，提供了一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方 法。
【背景技术】
[0002] 鸭细小病毒是细小病毒的一种，主要侵害1~3周龄的维鸭，临床W腹泻、呼吸困 难和脚软为主要症状，一年四季均有发生，给鸭饲养带来极大的经济损失，是鸭饲养中主要 的疾病之一，发病率和死亡率也较高。
[0003] 2015年3月W来，我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病，经验证为鸭 细小病毒，该病W鸭瞭发育不良，舌头外伸为特征，本病主要发生在14日龄W上的商品鸭， 鸭群发病率为10% -20%，最高可达50%，大群感染率最高可达100%，但该病不造成患鸭 死亡。患鸭发育迟缓，体溫略升高，瞭短，弹性降低，舌肿胀，外伸，感染后期患鸭腔骨和翅骨 易发生骨折。该病主要导致鸭群料肉比上升，养殖成本升高，鸭出栏合格率降低。对肉鸭养 殖业造成巨大的经济损失。
[0004] 众所周知，疫苗接种是防止疫病爆发和避免造成巨大经济损失的主要措施、关键 环节和最后防线。组织灭活苗和疫苗是鸭饲养行业中常用的生物制剂，由于该病为新发疫 病，目前国内外尚无预防该病的疫苗。因此，提供一种针对性的疫苗来防治该病成为亟待解 决的问题。
【发明内容】
[0005] 针对上述情况，本发明的发明人提供了一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备 方法，该毒株为鸭细小病毒，具体命名为GT2015株，其生物保藏编号为CCTCCNo:V201527 ; 利用该毒株制备的疫苗有效解决了我国当前该病无法预防的现状，提高肉鸭的出栏合格 率，降低肉鸭养殖的料肉比，减少了该病造成了经济损失，制备方法简单，短时间内可制备 完毕；安全性高，对环境没有任何不良影响；使用操作方便，使用时取出组织灭活苗注射即 可；适于规模化批量生产和应用；免疫效率高，接种后保护率可至100% ;保质期可达12个 月。
[0006] 发明人首先对上述病毒进行了分离和鉴定，最终确定上述疾病为鸭细小病毒 值UckParvovirusDPV)感染引起的一种鸭细小病毒病。进而发明人获得了一株新鸭细 小病毒毒株，通过毒种的分离培养、碟胚中和试验、病毒的PCR检测及病毒的测序检测实 验，确定该毒株为一株新的鸭细小病毒，命名为鸭细小病毒GT2015株。本发明鸭细小病毒 GT2015株的分离结果显示：本病毒能在鸭胚及其制备的的原代细胞培养物中增殖并形成 病变，且随着传代次数的增加，病变越来越明显。但是该病毒不能够在鸡胚、碟胚上增殖。鸭 胚盲传3代可见绒毛尿囊膜水肿、增厚，颈部、胸部、爪、翅尖及瞭旁均有出血，头及颈部水 肿。收获的鸭胚尿囊液经红细胞凝集试验检测无血凝活性。
[0007] 发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中屯、，生物保 藏编号为CCTCCNo:V201527。
[0008] 在分离获得上述毒株的基础上，发明人进一步获得了该毒株的灭活疫苗，同时提 供了该鸭细小病毒灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
[0009] (1)病毒增殖程序将GT2015株按照0. 2血/胚接种9日龄健康鸭胚，12化后收获 病毒尿囊液，-20°C下保存；
[0010] (2)病毒的灭活病毒尿囊液过滤处理，加入甲醒溶液至终浓度（体积分数吗？） 为0. 1 %，然后再37°C灭活16h，期间振摇3-4次，保存于4°C;
[0011] (3)灭活疫苗的的制备
[0012] a.油相的制备白油94份、司盘-80 6份，混合后加热，加入硬脂酸侣2份混合均 匀，即得油相；
[0013]b.水相的制备吐溫-80 4份、灭活浓缩后的病毒抗原液96份，混合均匀，即得水 相；
[0014]C.混合与乳化6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速揽拌，同时缓慢加入3份水 相，加完后W8000-10000r/min乳化3分钟，然后加入1份水相，继续揽拌30秒，在终止 揽拌前加入w/v1 %硫柳隶水溶液，使其终浓度w/v为万分之一即得。
[0015] 获得灭活疫苗之后即可通过各种手段检验疫苗的效果，结果表明制备的鸭细小病 毒灭活疫苗具有稳定的物理性状和安全性，种鸭免疫后可W使子代维鸭获得抵抗鸭细小病 毒感染，特别是针对GT2015株的抗感染能力。
[0016] 综上所述，本发明首次提出了利用鸭细小病毒GT2015株制备鸭细小病毒灭活疫 苗，该疫苗的研制有效解决了我国当前该病无法预防的现状，提高肉鸭的出栏合格率，降低 肉鸭养殖的料肉比，减少了该病造成了经济损失。用GT2015株制备灭活疫苗，方法简单，短 时间内可制备完毕；安全性高，对环境没有任何不良影响；使用操作方便，使用时取出组织 灭活苗注射即可；适于规模化批量生产和应用；免疫效率高，接种后保护率可至100% ;保 质期长（可达12个月）；灭活苗的病毒株可W通过本发明的制备方法长期保存，循环利用。 目前该病在我国南方地区的番鸭、半番鸭群和北方地区的肉鸭群中均有流行，该疫苗的制 备为我国有效防控该病提供了技术保障。
[0017] 发明人对本发明所公开的鸭细小病毒GT2015进行了生物保藏，保藏单位为中国 典型培养物保藏中屯、，具体保藏信息如下：
[0018] 保藏信息
[0019] 保藏时间：2015年8月28日
[0020] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中屯、CCTCC
[0021] 保藏编号：CCTCCNO:V201527
[0022] 保藏单位地址：中国武汉大学
[0023] 分类命名：鸭细小病毒GT2015
【附图说明】
[0024] 图1为鸭细小病毒GT2015株的PCR检测结果，其中M为DL2000DNAmarker, 1 : 组织样本PCR扩增结果；2、3、4、5分别为第2-5代病毒液PCR扩增结果；
[002引图2为不同水禽细小病毒的VP3基因序列比较分析图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] 病毒的分离和鉴定
[0028] 2015年4月，对采集自山东高唐地区的患鸭，临床表现为发育迟缓，上下瞭萎缩 等，取肝脏经研磨、冻融、过滤除菌后，接种于9日龄鸭胚，进行病毒分离，并对分离株进行 PCR、EID50毒价测定、动物回归试验等鉴定。结果显示，成功扩增得到目的片段；病毒毒力 为10& 7EID50/0. 2mL;动物感染试验的接种鸭出现明显的临床症状和病理变化，与临床发病 鸭一致。由此确定分离株为鸭细小病毒，命名为GT2015株，发明人对其进行生物保藏，保藏 编号（CCTCCNo:V201528)。具体过程如下：
[0029] 1.病料的处理取短瞭长舌症状患鸭的肝脏，按常规方法匀浆、反复冻融3次， 4°C，12000r/min离屯、lOmin，取上清液，-20°C冻存备用。
[0030] 2.病毒鸭胚分离传代将上清过滤后，按照0. 2血/胚尿囊膜接种9日龄健康鸭胚， 12化后收获尿囊液，盲传S代。可见鸭胚尿囊膜浑浊、增厚，分离的毒株命名为GT2015株， 将该毒株继续传代，至第五代时病毒增殖状况良好，提取2-5代病毒尿囊液DNA，进行PCR检 ，检测结果均为阳性（如图1所示）。
[0031] 3.GT2015株的鉴定分别采用禽流感病毒、新城疫病毒、鸭攝病毒、坦布苏病毒、禽 腺病毒、I型