一种倍半萜内酯类化合物、其制备方法以及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物活性成分技术领域，设及从中药中提取、制备有效成分和应 用的领域，尤其是设及一种菊科泽兰属植物中一个新颖倍半祗内醋的制备方法及其癌症治 疗应用。
【背景技术】
[0002] 菊科（Compositae)泽兰属巧upatoriumL.)植物全世界约600余种，主要分布于 中南美洲的溫带及热带地区。我国有14种，若干个变种，除新疆、西藏外全国均产。泽兰属 作为药用的植物，目前应用较多的有林泽兰等八个种。该属植物具有悠久的用药历史。
[0003] 野马追为菊科泽兰属植物林泽兰巧upatoriumIindl巧anumDC.)的干燥地上部 分，在我国分布较广，具有多年用药历史，现被我国2015版药典收载。野马追，味苦性平，归 肺经，具有清热解毒，化疲止咳、平喘等功效。野马追枝叶有解表桂湿，和中化湿之效，用于 劳伤咳嗽、吐血咳血W及淋浊白带、无名肿痛等治疗。
[0004] 野马追已被开发成颗粒剂、糖浆剂等多种中成药广泛应用于临床。野马追糖浆是 名优中成药，主要用于呼吸系统疾病的治疗，产生了显著的社会及经济效益。
[0005] 野马追药材中含有丰富的结构新颖的倍半祗内醋类成分，该类成分普遍含有 "a-0不饱和幾基"结构单元，为一类典型的迈克尔反应受体分子（Michaeladdition acceptors)。迈克尔反应受体分子具有显著生物活性，特别是对细胞信号传导通路中含有 半脫氨酸残基的蛋白、酶，如STAT3、CDK、化p90、NF-KB等具有抑制活性，迈克尔反应受体 分子已成为小分子生物药物研究的热点之一。
[0006] 迄今为止，虽然从泽兰属植物中分离得到了一系列倍半祗内醋类化合物，但并没 有提供一种工艺简单、科学合理，有效成分理化性质稳定、生物活性显著的菊科泽兰属植 物倍半祗内醋类化合物及其制备方法。
[0007] 在野马追糖浆等中成药制剂的应用方面，该类制剂多用于化疲、止咳、平喘等呼吸 系统疾病的治疗，检测的指标成分或有效成分W黄酬、生物碱为主，野马追及其制剂在癌症 治疗方面的应用鲜有报道。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种新颖倍半祗内醋、其制备方法W及应用，该倍半祗内醋 具有较好的抗癌活性，同时该制备方法工艺操作简单、科学合理，能够得到理化性质稳定， 纯度较高的倍半祗内醋类化合物。
[0009] 一种倍半祗内醋类化合物，结构如式（I)所示：
[0010] (I)
[0011] 该化合物的结构目前未见有文献报道，同时MT试验表明该化合物对两株人源乳 腺癌细胞具有显著的抑制作用，给药24h后，对两株人源肿瘤细胞株的半数抑制浓度（ICJ 为：2.67~3.05ymol/L。具有抗肿瘤活性。
[0012] 本发明还提供了一种所述倍半祗内醋类化合物的制备方法，包括下述步骤：
[0013] (A)提取：采用提取溶剂对药材进行提取，得到提取液；
[0014] 所述的药材为菊科泽兰属植物的干燥地上部分和/或全草；
[001引 做萃取：对步骤（A)得到的提取液进行浓缩，得到的浓缩物加水混悬，然后采用 萃取溶剂进行萃取得到萃取液，萃取液经过浓缩，得到粗提物；
[0016] 似柱层析：步骤做得到的粗提物上正相柱，用洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液， 减压回收溶剂，得到富含所述倍半祗内醋化合物的提取物；
[0017] 做中压柱层析：步骤似得到的提取物进行中压柱层析分离，得到含有式（1) 所示化合物的粗产品。所述的中压柱层析中，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶；所述中压 柱层析流动相至少包括40~70%的甲醇水溶液；
[0018] 巧）制备型高效液相柱层析：步骤值）得到的粗产品进行制备型高效液相柱层析， 得到如式（1)所示的化合物。所述制备型高效液相柱层析中，色谱柱填料为十八烷基键合 相硅胶；所述制备型高效液相柱层析流动相至少包括20~40%的乙腊水溶液。
[0019] 步骤A中，药材的提取方法较多，包括渗漉法。渗漉法提取效率高，提取溶剂用量 少，常溫提取能耗低，简便可行。渗漉法在常溫下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏。
[0020] 步骤B中，萃取溶剂可W有多种选择，但至少要包括乙酸乙醋。乙酸乙醋极性大于 现有技术中的石油酸、乙酸、二氯甲烧、氯仿，能够将泽兰属植物提取物中倍半祗内醋类成 分萃取完全；乙酸乙醋极性小于现有技术中的正下醇，不但能将倍半祗内醋类成分完全萃 取出来，还能够剔除一些易溶于正下醇的极性较大的巧类杂质，从而使得泽兰属植物粗提 物中倍半祗内醋类活性成分的含量更高，纯度更高。
[0021] 步骤C中，洗脱剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱剂选择性高， 洗脱能力强，能够保证得到理化性能稳定、所述化合物分布集中的提取物。
[0022] 所述的洗脱剂包括由体积比为20~0 :1的石油酸和乙酸乙醋组成的洗脱剂。
[0023] 步骤D中，所述的中压柱层析为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶。所 述中压柱层析流动相至少包括40~70%的甲醇水溶液。
[0024] 步骤E中，所述的制备型高效液相柱层析亦为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基 键合相硅胶，流动相至少包括20~40%的乙腊水溶液。
[0025] 为了取得更好的发明效果，W下作为本发明的优选：
[0026] 步骤（A)中，所述药材为野马追巧upatoriumIindleyanumDC.)的干燥全草，野 马追被2015版中国药典收载，价廉易得。
[0027] 所述提取溶剂为水、醇中的一种或两种，该提取溶剂使用安全、价廉、且具有较好 的提取效率。进一步优选，所述提取溶剂为含乙醇质量分数为90~95%的乙醇水溶液。该 提取溶剂的性质非常适合于提取泽兰属植物干燥地上部分和/或全草，能够更加高效、完 全地获取药用部位中的倍半祗内醋类活性成分，且能避免大量极性较大的非倍半祗内醋类 杂质被提取出来。
[0028] 所述提取方法为溶剂提取法。进一步优选，所述提取方法为渗漉法。药材打粉， 过40目筛，药粉润湿后装柱，加90~95%乙醇冷浸2地，渗漉，提取溶剂与药材的用量比为 15~20L:化g。该法提取效率高，提取溶剂用量少，常溫下提取能耗低，且能避免热敏性 活性成分的降解，渗漉设备简单，也能大量节约生产成本。
[0029] 步骤度）中，所述的萃取溶剂为石油酸、乙酸、二氯甲烧、氯仿、乙酸乙醋、正下醇、 水中的两种W上。萃取时按极性由小到大依次使用单一溶剂进行萃取。进一步优选，所述 的萃取溶剂为石油酸、乙酸乙醋，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。根 据相似相溶原理，分别通过上述萃取溶剂萃取，W使步骤A得到的药材提取液浓缩加水混 悬后的溶液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱（TLC)、LC-MS检识，泽兰属植物萃取液 中的倍半祗内醋主要集中在乙酸乙醋萃取液中，其它萃取溶剂主要用于去除药材提取物中 非倍半祗内醋类杂质，W得到富含倍半祗内醋的粗提物。因此，进一步优选，将乙酸乙醋萃 取液浓缩，乙酸乙醋提取物上正相柱进一步纯化，其余的可W忽略，从而减少生产成本。
[0030] 步骤（C)中，所述正相柱填料为100~200目的柱层析用硅胶或氧化侣。
[0031] 所述的洗脱剂包括由体积比为20 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂、由体 积比为15 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂、由体积比为10 : 1的石油酸和乙酸 乙醋组成的混合溶剂、由体积比为6 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂、由体积比为 3 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂、由体积比为2 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的 混合溶剂、由体积比为1 : 1的石油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂、由体积比为0 : 1的石 油酸和乙酸乙醋组成的混合溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。采用石油酸和乙 酸乙醋组成的洗脱剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱，该洗脱体系选择性高，洗脱能 力强，通过化C、LC-MS检识，本发明所述新颖倍半祗内醋几乎全部位于体积比为0 : 1的石 油酸和乙酸乙醋组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得泽兰属植物粗提物中新颖倍半祗 内醋活性成分含量更高，分布更加集中。
[0032] 步骤值）（巧中，所述的中压色谱及制备型高效液相色谱填料均为十八烷基键合 相硅胶，该填料对倍半祗内醋类化合物具有较强的选择性，分离效果好。中压柱层析，具有 上样量大，分离效率高等优势。
[0033] 步骤（C)得到的富含新颖倍半祗内醋的提取物，用四氨巧喃溶解后，湿法上样，分 别用45 %、65 %的甲醇水溶液洗脱，该流动相洗脱能力强，所述新颖倍半祗内醋几乎全部集 中在65%甲醇水洗脱的部分流分中。