利用ppr基序的dna结合性蛋白质及其应用_4

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N)的组合(*IN);
[0188] (1-3)第4氨基酸为亮氨酸(L)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均可 以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0189] ?任意的氨基酸与天冬氨酸⑶的组合(*LD)、或
[0190] ?任意的氨基酸与赖氨酸(K)的组合(*LK);
[0191] (1-4)第4氨基酸为甲硫氨酸(M)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均 可以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0192] ?任意的氨基酸与天冬氨酸⑶的组合(*MD)、或
[0193] ?异亮氨酸⑴与天冬氨酸⑶的组合(MD);
[0194] (1-5)第4氨基酸为天冬酰胺(N)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均 可以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0195] ?任意的氨基酸与天冬氨酸(D)的组合(*ND)、
[0196] ?苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)中 的任一者与天冬氨酸⑶的组合(FND、GND、IND、TND、VND或YND)、
[0197] ?任意的氨基酸与天冬酰胺(N)的组合(*_、
[0198] ?异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)中的任一者与天冬酰胺(N)的组合(INN、 SNN 或 VNN)、
[0199] ?任意的氨基酸与丝氨酸⑶的组合(*NS)、
[0200] ?缬氨酸(V)与丝氨酸⑶的组合(VNS)、
[0201] ?任意的氨基酸与苏氨酸(T)的组合(*NT)、
[0202] ?缬氨酸(V)与苏氨酸⑴的组合(VNT)、
[0203] ?任意的氨基酸与色氨酸(W)的组合(*NW)、或
[0204] ?异亮氨酸⑴与色氨酸(W)的组合(INW);
[0205] (1-6)第4氨基酸为脯氨酸(P)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均可 以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0206] ?任意的氨基酸与天冬氨酸(D)的组合(*ro)、
[0207] ?苯丙氨酸(F)与天冬氨酸⑶的组合(FPD)、或
[0208] ?酪氨酸(Y)与天冬氨酸⑶的组合(YPD);
[0209] (1-7)第4氨基酸为丝氨酸⑶的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均可 以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0210] ?任意的氨基酸与天冬酰胺(N)的组合(*SN)、
[0211] ?苯丙氨酸(F)与天冬酰胺(N)的组合(FSN)、或
[0212] ?缬氨酸(V)与天冬酰胺(N)的组合(VSN);
[0213] (1-8)第4氨基酸为苏氨酸(T)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均可 以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0214] ?任意的氨基酸与天冬氨酸(D)的组合(*TD)、
[0215] ?缬氨酸(V)与天冬氨酸⑶的组合(VTD)、
[0216] ?任意的氨基酸与天冬酰胺(N)的组合(*TN)、
[0217] ?苯丙氨酸(F)与天冬酰胺(N)的组合(FTN)、
[0218] ?异亮氨酸⑴与天冬酰胺(N)的组合(ITN)、或
[0219] ?缬氨酸(V)与天冬酰胺(N)的组合(VTN);
[0220] (1-9)第4氨基酸为缬氨酸(V)的情况下,第1氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸均可 以为任意的氨基酸,作为一例,作为第1氨基酸与第"ii"(-2)氨基酸的组合,可以为:
[0221] ?异亮氨酸⑴与天冬氨酸⑶的组合(IVD)、
[0222] ?任意的氨基酸与甘氨酸(G)的组合(*VG)、或
[0223] ?任意的氨基酸与苏氨酸(T)的组合(*VT)。
[0224] (II)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸的组合与DNA 碱基的对应的相关信息。
[0225] 具体而目,蛋白质是基于如下情况确定的蛋白质,其具有选择性的DNA喊基结合 能力。
[0226] (2-1)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、甘氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与G选择性地结合;
[0227] (2-2)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(_2)氨基酸这3个氨基酸依次为谷氨酸、 甘氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与G选择性地结合;
[0228] (2-3)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、甘氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0229] (2-4)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(_2)氨基酸这3个氨基酸依次为谷氨酸、 甘氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0230] (2-5)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、甘氨酸、丝氨酸时,该PPR基序与A选择性地结合,其次与C结合;
[0231] (2-6)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、异亮氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与T和C选择性地结合;
[0232] (2-7)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、异亮氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与T选择性地结合,其次与C结合;
[0233] (2-8)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、亮氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与T和C选择性地结合;
[0234] (2-9)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的 氨基酸、亮氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0235] (2-10)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、亮氨酸、赖氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0236] (2-11)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、甲硫氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0237] (2-12)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、甲硫氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0238] (2-13)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合,其次与C结合;
[0239] (2-14)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、任意的氨基酸时,该PPR基序与C和T选择性地结合;
[0240] (2-15)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0241] (2-16)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙 氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0242] (2-17)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为甘氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0243] (2-18)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0244] (2-19)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苏氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0245] (2-20)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合,其次与C结合;
[0246] (2-21)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为酪氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合,其次与C结合;
[0247] (2-22)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、天冬酰胺时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0248] (2-23)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0249] (2-24)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为丝氨 酸、天冬酰胺、天冬酰胺时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0250] (2-25)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、天冬酰胺、天冬酰胺时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0251] (2-26)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、丝氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0252] (2-27)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、天冬酰胺、丝氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0253] (2-28)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、苏氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0254] (2-29)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、天冬酰胺、苏氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0255] (2-30)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、天冬酰胺、色氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合,其次与T结合;
[0256] (2-31)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、天冬酰胺、色氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合,其次与C结合;
[0257] (2-32)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、脯氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0258] (2-33)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、脯氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0259] (2-34)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙 氨酸、脯氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0260] (2-35)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为酪氨 酸、脯氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合;
[0261] (2-36)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、丝氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与A和G选择性地结合;
[0262] (2-37)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、丝氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0263] (2-38)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙 氨酸、丝氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0264] (2-39)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、丝氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0265] (2-40)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、苏氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与A和G选择性地结合;
[0266] (2-41)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、苏氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与G选择性地结合;
[0267] (2-42)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、苏氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与G选择性地结合;
[0268] (2-43)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、苏氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0269] (2-44)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙 氨酸、苏氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0270] (2-45)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、苏氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0271] (2-46)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨 酸、苏氨酸、天冬酰胺时,该PPR基序与A选择性地结合;
[0272] (2-47)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、缬氨酸、任意的氨基酸时,该PPR基序与A、C和T结合,但不与G结合;
[0273] (2-48)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮 氨酸、缬氨酸、天冬氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合,其次与A结合;
[0274] (2-49)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、缬氨酸、甘氨酸时,该PPR基序与C选择性地结合;
[0275] (2-50)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意 的氨基酸、缬氨酸、苏氨酸时,该PPR基序与T选择性地结合。
[0276] 特定位置的氨基酸的特定组合与DNA碱基的结合性可通过实验来确认。基于这种 目的的实验包括:PPR基序或含有多个PPR基序的蛋白质的制备、底物DNA的制备、以及结 合性试验(例如,凝胶迀移法)。各实验对于本领域技术人员而言是熟知的,作为更具体的 程序、条件,例如可将专利文献2作为参考。
[0277] [PPR基序和PPR蛋白质的利用]
[0278] 鉴宙和设计:
[0279] 一个PPR基序识别DNA的一个特定碱基,连续的多个PPR基序可识别DNA序列中 的连续的碱基。并且,基于本发明,通过适当选择特定位置的氨基酸,能够选择或设计对A、 T、G、C各自具有选择性的PPR基序,进而,含有适当连续的这样的PPR基序的蛋白质能够识 别对应的特异性序列。因此,基于本发明,能够预测、鉴定与具有特定碱基序列的DNA选择 性地结合的天然型PPR蛋白质,另外,反过来能够预测、鉴定作为PPR蛋白质的结合靶标的 DNA。靶标的预测、鉴定对于明确基因的实质是有用的,另外在能够扩大靶标的利用可能性 的方面也是有用的。
[0280] 此外,根据本发明,可以设计出能够与所期望的DNA碱基选择性地结合的PPR基 序、以及能够与所期望的DNA序列特异性地结合的具有多个PPR基序的蛋白质。在进行设 计时,PPR基序中的重要位置的氨基酸以外的部分可以参考SEQ ID NO :1至5记载的DNA 结合型PPR蛋白质中的天然型PPR基序的序列信息。另外,也可以通过使用天然型作为整 体、仅置换相应位置的氨基酸来进行设计。PPR基序的重复数可根据靶标序列适当设定,例 如可以为2个以上、优选为2~30个、更优选为5~25个、
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