中含有的一个PPR基序（Μη)为下述的PPR基序： 在将螺旋Α的起始氨基酸作为第1氨基酸、将第4位的氨基酸作为第4氨基酸、并且 将下述氨基酸作为第"ii"（-2)氨基酸时，所述PPR基序具有第1氨基酸、第4氨基酸和第 "ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸作为与对象DNA碱基或对象DNA碱基序列对应的特定的氨 基酸的组合， 所述作为第"ii"（-2)氨基酸的氨基酸为： ?在PPR基序（Mn)的C末端侧连续存在下一个PPR基序（ΜΛ)时（在PPR基序间无氨 基酸插入时），从构成PPR基序（Mn)的氨基酸的最后位（C末端侧）起的第-2位氨基酸； ?在PPR基序（Mn)与其C末端侧的下一个PPR基序（MA)之间发现1~20个氨基酸 的非PPR基序时，从下一个PPR基序（MA)的第1氨基酸起向上游侧数2位、即第-2位氨 基酸；或者 ?在PPR基序（Mn)的C末端侧未发现下一个PPR基序（MA)时、或者在与C末端侧的 下一个PPR基序（ΜΛ)之间发现21个氨基酸以上的构成非PPR基序的氨基酸的情况下，从 构成PPR基序（Mn)的氨基酸的最后位（C末端侧）起的第2位氨基酸。2. 如权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质中，使第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2) 氨基酸这3个氨基酸的组合与对象DNA碱基或对象DNA碱基序列对应，其中，氨基酸的组合 基于下述任意一种情况来确定： (1-1)第4氨基酸为甘氨酸（G)的情况下，第1氨基酸可以为任意的氨基酸，且第 "ii"（-2)氨基酸为天冬氨酸（D)、天冬酰胺（N)或丝氨酸（S); (1-2)第4氨基酸为异亮氨酸⑴的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以 为任意的氨基酸； (1-3)第4氨基酸为亮氨酸（L)的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以为 任意的氨基酸； (1-4)第4氨基酸为甲硫氨酸（M)的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以 为任意的氨基酸； (1-5)第4氨基酸为天冬酰胺（N)的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以 为任意的氨基酸； (1-6)第4氨基酸为脯氨酸⑵的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以为 任意的氨基酸； (1-7)第4氨基酸为丝氨酸⑶的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以为 任意的氨基酸； (1-8)第4氨基酸为苏氨酸（T)的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以为 任意的氨基酸； (1-9)第4氨基酸为缬氨酸（V)的情况下，第1氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸均可以为 任意的氨基酸。3.如权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质中，使第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2) 氨基酸这3个氨基酸的组合与对象DNA碱基或对象DNA碱基序列对应，其中，氨基酸的组合 基于下述任意一种情况来确定： (2-1)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、甘氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与G选择性地结合； (2-2)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为谷氨酸、甘 氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与G选择性地结合； (2-3)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、甘氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-4)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为谷氨酸、甘 氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-5)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、甘氨酸、丝氨酸时，该PPR基序与A选择性地结合，其次与C结合； (2-6)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、异亮氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与T和C选择性地结合； (2-7)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、异亮氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与T选择性地结合，其次与C结合； (2-8)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、亮氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与T和C选择性地结合； (2-9)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨基 酸、亮氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-10)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、亮氨酸、赖氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-11)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、甲硫氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-12)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、甲硫氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-13)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 甲硫氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合，其次与C结合； (2-14)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、任意的氨基酸时，该PPR基序与C和T选择性地结合； (2-15)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-16)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-17)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为甘氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-18)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-19)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苏氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-20)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合，其次与C结合； (2-21)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为酪氨酸、天 冬酰胺、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合，其次与C结合； (2-22)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、天冬酰胺时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-23)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 天冬酰胺、天冬酰胺时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-24)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为丝氨酸、天 冬酰胺、天冬酰胺时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-25)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、天 冬酰胺、天冬酰胺时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-26)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、丝氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-27)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、天 冬酰胺、丝氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-28)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、苏氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-29)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、天 冬酰胺、苏氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-30)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、天冬酰胺、色氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合，其次与T结合； (2-31)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 天冬酰胺、色氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合，其次与C结合； (2-32)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、脯氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-33)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、脯氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-34)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙氨酸、 脯氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-35)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为酪氨酸、脯 氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合； (2-36)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、丝氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与A和G选择性地结合； (2-37)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、丝氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-38)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙氨酸、 丝氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-39)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、丝 氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-40)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、苏氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与A和G选择性地结合； (2-41)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、苏氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与G选择性地结合； (2-42)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、苏 氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与G选择性地结合； (2-43)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、苏氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-44)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为苯丙氨酸、 苏氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-45)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 苏氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-46)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为缬氨酸、苏 氨酸、天冬酰胺时，该PPR基序与A选择性地结合； (2-47)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、缬氨酸、任意的氨基酸时，该PPR基序与A、C和T结合，但不与G结合； (2-48)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸这3个氨基酸依次为异亮氨酸、 缬氨酸、天冬氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合，其次与A结合； (2-49)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、缬氨酸、甘氨酸时，该PPR基序与C选择性地结合； (2-50)第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸依次为任意的氨 基酸、缬氨酸、苏氨酸时，该PPR基序与T选择性地结合。4. 如权利要求1~3中任一项所述的蛋白质，其含有2个~30个权利要求1中定义的 PPR基序（Mn)。5. 如权利要求1~3中任一项所述的蛋白质，其含有5个~25个权利要求1中定义的 PPR基序（Mn)。6. 如权利要求1~3中任一项所述的蛋白质，其含有9个~15个权利要求1中定义的 PPR基序（Mn)。7. 如权利要求6所述的PPR蛋白质，其由选自具有9个PPR基序的SEQIDNO: 1的氨 基酸序列、具有11个PPR基序的SEQIDNO: 2的氨基酸序列、具有15个PPR基序的SEQID NO:3的氨基酸序列、具有10个PPR基序的SEQIDNO:4的氨基酸序列、具有11个PPR基 序的SEQIDNO:5的氨基酸序列中的序列构成。8. -种对作为DNA结合性蛋白质的靶标的DNA碱基或DNA碱基序列进行鉴定的方法， 该DNA结合性蛋白质含有1个以上（优选2个~30个）的权利要求1中定义的PPR基序 (Mn)，该方法中， 鉴定通过下述方式进行：基于权利要求2所述的（1-1)~（1-9)或权利要求3所述的 (2-1)~（2-50)中的任意一种情况来认定有无与PPR基序的第1氨基酸、第4氨基酸和第 "ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸的组合对应的DNA碱基。9. 一种对PPR蛋白质进行鉴定的方法，该PPR蛋白质能够与靶标DNA碱基或具有特定 碱基序列的靶标DNA结合、且含有1个以上（优选2个~30个）的权利要求1中定义的 PPR基序（Mn)，该方法中， 鉴定通过下述方式进行：基于权利要求2所述的（1-1)~（1-9)或权利要求3所述的 (2-1)~（2-50)中的任意一种情况来认定有无与靶标DNA碱基或构成靶标DNA的特定碱基 对应的PPR基序的第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸这3个氨基酸的组合。10. -种DNA的功能的调控方法，其使用权利要求1所述的蛋白质。11. 一种复合体，其通过将由权利要求1所述的蛋白质构成的区域与功能性区域连结 而形成。12. 如权利要求11所述的复合体，该复合体通过在权利要求1所述的蛋白质的C末端 侧融合功能性区域而形成。13. 如权利要求11或12所述的复合体，其中，功能性区域为DNA切割酶或其核酸酶结 构域、或者转录调控结构域，复合体作为靶标序列特异性DNA切割酶或转录调控因子发挥 功能。14. 如权利要求13所述的复合体，其中，DNA切割酶为FokI的核酸酶结构域（SEQID NO：6) 〇15. -种对细胞的遗传物质进行改造的方法，其包括下述步骤： 准备含有具有靶标序列的DNA的细胞；并且 将权利要求11所述的复合体导入到细胞中，由此复合体的由蛋白质构成的区域与具 有靶标序列的DNA结合，因此功能性区域对具有靶标序列的DNA进行改造。16. -种使用含有1个以上PPR基序的PPR蛋白质对DNA碱基或具有特定碱基序列的 DNA进行鉴定、识别或祀标化的方法。17. 如权利要求16所述的方法，其中，蛋白质含有1个以上的PPR基序，构成该PPR基 序的氨基酸中的3个为特定的氨基酸的组合。18. 如权利要求16或17所述的方法，其中，蛋白质含有1个以上的权利要求1中定义 的PPR基序（Μη)。
【专利摘要】基于PPR基序所具有的RNA识别规则也能够用于DNA识别的推测，设定了如下课题：对于在DNA结合中起作用的PPR蛋白质进行分析，探寻具有这种特征的PPR蛋白质。本发明中明确了，利用一种能够选择性地结合DNA碱基或者能够特异性地结合DNA碱基序列的蛋白质能够解决上述课题，该蛋白质含有多个、优选2～30个、更优选5～25个、最优选9～15个的具有下述式1结构的PPR基序(式1中：螺旋A为能够形成α螺旋结构的部分；X不存在或者为由长度1～9个的氨基酸构成的部分；螺旋B为能够形成α螺旋结构的部分；并且L为由长度2～7个的氨基酸构成的部分)，该PPR基序具有式1中的螺旋A的第1氨基酸、第4氨基酸、以及L中含有的第“ii”(-2)氨基酸这3处氨基酸作为与DNA碱基或对象碱基序列对应的特定的氨基酸的组合。(螺旋A)-X-(螺旋B)-L(式1)。
【IPC分类】C07K4/10, C07K19/00, C07K14/415, C12N9/16, C12Q1/68
【公开号】CN105392796
【申请号】CN201480035686
【发明人】山本卓, 佐久间哲史, 中村崇裕, 八木祐介, 大川恭行
【申请人】国立大学法人九州大学, 国立大学法人广岛大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2014年4月22日
【公告号】CA2910050A1, EP3020722A1, US20160075744, WO2014175284A1