特别优选为9~15个。
[0281] 在进行设计时，也可以对第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸的组合以 外的氨基酸进行考虑。例如，前述专利文献2中记载的8位和12位氨基酸的考虑对于呈现 出DNA结合活性有时是很重要的。根据本发明人的研究，某一 PPR基序的8位氨基酸和与 其相同的PPR基序的12位氨基酸在DNA结合中可能具有协同性。8位氨基酸可以为碱性氨 基酸、优选为赖氨酸，或者可以为酸性氨基酸、优选为天冬氨酸，12位氨基酸可以为碱性氨 基酸或中性氨基酸或疏水性氨基酸。
[0282] 设计出的基序或蛋白质可利用本领域技术人员公知的方法来制备。即，本发明提 供着眼于第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸的氨基酸的组合的与特定的DNA碱 基选择性地结合的PPR基序、以及与具有特定序列的DNA特异性地结合的PPR蛋白质。这 样的基序和蛋白质可以利用本领域技术人员公知的方法比较大量地制备，这样的方法可以 包括从目的基序或蛋白质所具有的氨基酸序列确定编码其的核酸序列、进行克隆化、制作 生产目的基序或蛋白质的转化体。
[0283] 复合体的制备及其应用：
[0284] 由本发明提供的PPR基序或PPR蛋白质可以连结功能性区域而制成复合体。功能 性区域通常是指在生物体内或细胞内具有特定的生物学功能例如酶功能、催化功能、抑制 功能、促进功能等功能的部分、或者具有作为标记的功能的部分。这样的区域例如由蛋白 质、肽、核酸、生理活性物质、药剂构成。
[0285] 在本发明中，通过在PPR蛋白质上连结功能性区域，能够组合发挥出由PPR蛋白质 发挥的靶标DNA序列结合功能以及由功能性区域发挥的功能。例如，通过使用具有DNA切 割功能的蛋白质（例如FokI等限制酶）或其核酸酶结构域作为功能性区域，复合体能够作 为人工DNA切割酶发挥功能。
[0286] 为了制造这样的复合体，可以利用该技术领域通常可利用的方法，已知有下述方 法：将复合体作为1个蛋白质分子进行合成的方法；分别合成多个蛋白质的部件后，将这些 部件组合而形成复合体的方法；等等。
[0287] 作为一例，在将复合体作为1个蛋白质分子进行合成的方法的情况下，可以设计 出在PPR蛋白质的C末端经由氨基酸接头融合切割酶而成的蛋白质复合体，构建用于表达 该蛋白质复合体的表达用载体结构体，由该结构体表达目的复合体。关于这样的制备方法， 可以使用日本特愿2011-242250中记载的方法等。
[0288] PPR蛋白质与功能性区域蛋白质的连结可以使用藉由氨基酸接头的连结、藉由亲 和素-生物素等的特异性亲和性的连结、藉由其他化学接头的连结等该技术领域中已知的 任意一种连结手段。
[0289] 作为可以在本发明中利用的功能性区域，是指能够赋予各种功能中的DNA的切 害J、转录、复制、修复、合成、修饰等任意功能的区域。通过调整作为本发明特征的PPR基序 的序列，确定作为靶标的DNA的碱基序列，能够将几乎所有的DNA序列作为靶标来利用，使 用该靶标，能够利用DNA的切割、转录、复制、修复、合成、修饰等功能性区域所具有的功能 来实现基因组编辑。
[0290] 例如，在功能性区域的功能为DNA的切割功能的情况下，可提供将本申请发明中 制备的PPR蛋白质部分与DNA的切割区域连结而成的复合体。这样的复合体可以作为人工 DNA切割酶发挥功能，在利用PPR蛋白质部分识别作为靶标的DNA的碱基序列后，利用DNA 的切割区域对DNA进行切割。
[0291] 本发明中可以使用的具有切割功能的功能性区域的示例为作为脱氧核糖核酸内 切酶发挥功能的脱氧核糖核酸酶（DNase)。作为这样的DNase的示例，可以利用DNase A(例 如牛胰核糖核酸酶A:PDB 2AAS)、DNase H、DNase I等脱氧核糖核酸内切酶、或者来源于各 种细菌的限制酶（例如FokI(SEQ ID NO :6)等）或其核酸酶结构域。这样的含有PPR蛋白 质和功能性区域的复合体并非天然存在的，是新的复合体。
[0292] 在功能性区域的功能为转录调控功能的情况下，可提供将本申请发明中制备的 PPR蛋白质部分与DNA的转录调控区域连结而成的复合体。这样的复合体可以作为人工转 录调控因子发挥功能，在利用PPR蛋白质部分识别作为靶标的DNA的碱基序列后，对目的 DNA的转录进行调控。
[0293] 本发明中可以使用的具有转录调控功能的功能性区域可以为转录活化结构域，也 可以为转录抑制结构域。转录调控结构域的示例为VP16、VP64、TA2、STAT-6、p65。这样的 含有PPR蛋白质和转录调控结构域的复合体并非天然存在的，是新的复合体。
[0294] 此外，由本发明得到的复合体具有能够以DNA序列特异性的方式将功能性区域输 送到生物体内或细胞内并使其发挥功能的可能性。由此，能够与利用锌指蛋白（上述非专 利文献1和非专利文献2)、TAL效应因子（上述非专利文献3、上述专利文献1)的蛋白质 复合体同样地在生物体内或细胞内进行DNA序列特异性的改造、破坏，能够赋予DNA切割及 利用该功能的基因组编辑这样的新功能。具体而言，能够利用多个可与特定碱基结合的PPR 基序连结而成的PPR蛋白质对特定的DNA序列进行识别。并且，通过与PPR蛋白质连结的 功能性区域，能够利用功能性区域所具有的功能来实现所识别的DNA区域的基因组编辑。
[0295] 此外，通过将药物与DNA序列特异性结合的PPR蛋白质结合，具有能够以该DNA序 列周边为靶标进行药物输送的可能性。因此，本发明还提供DNA序列特异性的功能性物质 的输送方法。
[0296] 已经明确了，在本发明中作为材料的PPR蛋白质发挥出指定DNA编辑的编辑部位 的作用，并且，这样的在第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸残基的位置配置有特 定氨基酸的PPR基序在识别DNA上的特异性碱基的基础上具有该DNA结合活性。基于这样 的特征，在第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸残基的位置配置有特定氨基酸的 这种类型的PPR蛋白质可以期待识别DNA上对各PPR蛋白质具有特异性的碱基，作为其结 果，可导入碱基多态性或对起因于碱基多态性的疾病或状态进行处置；此外，认为通过与上 述那样的其他功能性区域进行组合，能够有助于用于切割DNA、实现基因组编辑的功能的改 造 N提尚。
[0297] 另外，可以在PPR蛋白质的C末端侧融合外源性的DNA切割酶。或者，还可以通过 对N末端侧的PPR基序的结合DNA碱基选择性进行改良来构成DNA序列特异性的DNA切割 酶。另外，连结有GFP等标记部分的复合体还能够用于使所期望的DNA在生物体内可视化。
[0298] 实施例
[0299] 实施例1 :与DNA编辑相关的PPR蛋白质及其靶标序列的收集
[0300] 参照现有技术文献（非专利文献11~非专利文献15)中示出的信息，对p63蛋白 质（SEQ ID NO :1)、⑶Nl 蛋白质（SEQ ID NO :2)、pTac2 蛋白质（SEQ ID NO :3)、DG1 蛋白质 (SEQ ID N0:4)及GRP23蛋白质（SEQ ID N0:5)的结构和功能进行分析。
[0301] 这些蛋白质中的PPR基序结构中，连同Uniprot数据库（http://www. uniprot. org/)的信息，还赋予了本发明中定义的氨基酸编号。实验所用的5种拟南芥（SEQ ID NO: 1~5)的PPR蛋白质中含有的PPR基序及其氨基酸编号记载于图3。
[0302] 具体而言，在上述的p63蛋白质（SEQ ID NO :1)、GUNl蛋白质（SEQ ID NO :2)、 pTac2 蛋白质（SEQ ID NO :3)、DG1 蛋白质（SEQ ID NO :4)和 GRP23 蛋白质（SEQ ID NO :5) 中，对于在以RNA作为靶标的情况下被认为是重要的PPR基序中的承担核酸识别密码作用 的3处氨基酸（第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"(-2)氨基酸），将氨基酸出现频率与RNA 结合型基序进行比较。
[0303] 拟南芥的p63蛋白质（SEQ ID NO :1)具有9个PPR基序，并且将其氨基酸序列中的 第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii"（-2)氨基酸残基的位置汇总于下述的表中以及图3中。
[0304] 【表1】
[0306] 拟南芥的GUNl蛋白质（SEQ ID NO :2)具有11个PPR基序，并且将其氨基酸序列 中的第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸残基的位置汇总于下述的表中以及图3 中。
[0307] 【表2】
[0308]
[0309] 拟南芥的pTac2蛋白质（SEQ ID NO :3)具有15个PPR基序，并且将其氨基酸序列 中的第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸残基的位置汇总于下述的表中以及图3 中。
[0310] 【表3】
[0312] (B.G.表示背景）
[0313] 拟南芥的DGl蛋白质（SEQ ID NO :4)具有10个PPR基序，并且将其氨基酸序列 中的第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸残基的位置汇总于下述的表中以及图3 中。
[0314] 【表4】
[0316] (B.G.表示背景）
[0317] 拟南芥的GRP23蛋白质（SEQ ID NO : 5)具有11个PPR基序，并且将其氨基酸序列 中的第1氨基酸、第4氨基酸和第"ii" (-2)氨基酸残基的位置汇总于下述的表中以及图3 中。
[0318] 【表5】
[0320] (B. G.表示背景）
[0321] 在各蛋白质中对这些位置的氨基酸频率进行确认，与RNA结合型基序的情况下相 同位置的氨基酸频率进行比较。结果示于图2。明确了这些提示为DNA结合性的PPR蛋白 质的PPR基序与RNA结合型基序之间的氨基酸出现频率的倾向基本一致。即明确了，发挥 DNA结合作用的PPR蛋白质按照与发挥RNA结合作用的PPR蛋白质相同的序列规则与核酸 结合；本发明人在申请中的专利（PCT/JP2012/077274)中记载的RNA识别密码能够作为发 挥DNA结合作用的PPR蛋白质的DNA识别密码来应用。
[0322] 参考非专利文献（Yagi，Y.et al.，Plos 0ne，2013,8，e57286)的 RNA 识别密码， 对于与各碱基选择性地结合的DNA结合型PPR基序进行了评价。详细而言，基于表6所 示的碱基出现频率（occurrence nuceotide frequency)以及由背景频率计算出的期待值 (Expected nuceotide frequency)，通过卡方检验进行计算。检验在各碱基（NT)、噪呤/啼 啶（AG或CT ;PY)、氢键组（AT或GC ;HB)、或者氨基/酮型（AC或GT)中进行。将显著性值 设为P〈0. 06 (5. E-02 ;5%显著水平），在任一检验中得到了显著性值的情况下，选择第1氨 基酸、第4氨基酸、第"ii"（-2)氨基酸的组合。
[0323]【表6-1】
[0324] 表6. DNA结合密码的碱基选择性
[0325]
[0328] 表1中列举了显示出显著的碱基选择性的氨基酸的组合的情况。即，这些结果 意味着，具有得到了显著的P值的第1氨基酸、第4氨基酸、第"ii"（-2)氨基酸（表中为 (NSRs :l、4、ii)的氨基酸种的PPR基序为赋予了碱基选择性结合能力的PPR基序；并且，在 减除背景后，"正"的数值越大，对该碱基的碱基选择性越高。在第1氨基酸、第4氨基酸、 第" ii "（-2)氨基酸之中，第4氨基酸对碱基选择性的影响强，第" ii "（-2)氨基酸对碱基 选择性的影响次强，第1氨基酸对碱基选择性的影响在3个氨基酸之中弱。
[0329] 实施例2 :PPR分子的序列特异件DNA结合能力的评价
[0330] 在本实施例中，制作在p63、pTac2、GUNl这3种（被看作）DNA结合型的PPR分子上 融合作为转录活化结构域的VP64而成的人工转录因子，研究在人培养细胞内是否能够使 具有各靶标序列的荧光素酶报告基因活化，由此考察各PPR分子是否具有序列特异性DNA 结合能力（图5)。
[0331] (实验方法）
[0332] L PPR-VP64表达载体的制作
[0333] 通过人工合成来制作p63、pTac2、GUNl的编码序列中的仅相当于PPR基序的部分。 DNA合成利用了 Biomatik公司的人工基因合成服务。利用具有CMV启动子的pCS2P载体 作为骨架载体，插入合成的PPR序列。进而在PPR序列的N末端插入Flag标签和核转移信 号、在C末端插入VP64序列。所制作的p63-VP64、pTac2-VP64、GUNl-VP64的序列示于序列 表的 SEQ ID NO :7 ~9。
[0334] 2.具有PPR靶标序列的报告基因载体的制作
[0335] 制作在最小CMV启动子的下游连结有萤火虫的荧光素酶基因、在启动子的上游 配置有多克隆位点的报告基因载体（pminCMV-luc2、SEQ ID N0:10)。在该载体的多克 隆位点处插入各PPR的预测靶标序列。各PPR的靶标序列（P63为TCTATCACT、pTac2为 AACTTTCGTCACTCA、GUN1 为 AATTTGTCGAT。序列表的 SEQ ID NO :11 ~13)通过由 RNA 结合 型PPR中的基序-RNA间的识别密码预测DNA结合型PPR中的基序-DNA间的密码来确定。 对于各PPR，分别制作插入有4个靶标序列和插入有8个靶标序列的序列，用于下述分析。 各载体的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO :14~19。
[0336] 3.向HEK293T细胞中的转染
[0337] 使用 Life Technologies 公司的 Lipofectamine LTX 导入 1 中制作的 PPR-VP64 表达载体、2中制作的萤火虫荧光素酶表达载体、以及作为参比的Promega公司的pRL-CMV 载体（海肾荧光素酶的表达载体）。在96孔板的各孔中加入25 μ 1的DMEM培养基，进而加 入将PPR-VP64表达载体400ng、萤火虫荧光素酶表达载体IOOng和pRL-CMV载体20ng混合 而成的溶液。之后向各孔中加入DMEM培养基25 μ 1与Lipofectamine LTX 0. 7 μ 1混合而 成的溶液，在室温静置30分钟后，加入悬浮在100 μ 1的含有15%胎牛血清的DMEM培养基 中的6 X IO4细胞量的ΗΕΚ293Τ细胞，在37°C的CO 2孵箱中培养24小时。
[0338] 4.荧光素酶分析
[0339] 焚光素酶分析使用Promega公司的Dual-Glo焚光素酶分析系统，按照试剂盒的操 作说明书进行。焚光素酶活性的测定使用Berthold公司的TriStar LB 941酶标仪。
[0340] (结果、考察）
[0341] 在将pTac2-VP64和GUN1-VP64分别与作为阴性对照的pminCMV-luc2共导入的情 况下、以及与具有4个或8个靶标序列的报告基因载体共导入的情况下，对荧光素酶活性进 行了比较（下表、图6)。活性的比较基于用Fluc (萤火虫荧光素酶）的测定值除以参比的 Rluc (海肾荧光素酶）的测定值而进行了标准化的分数（Fluc/Rluc)来进行。其结果，在两 者中均观察到了活性随着靶标序列增加而上升的倾向，证明了这些PPR-VP64分子与各靶 标序列特异性地结合，作为位点特异性的转录活化因子发挥功能。
[0342] 【表7】
【主权项】
1. 一种能够选择性地结合DNA碱基或者能够特异性地结合DNA碱基序列的蛋白质，其 为含有1个以上的具有下述式1结构的PPR基序的蛋白质， 【化1】 (螺旋A) -X-(螺旋B)-L(式1) 式1中： 螺旋A为能够形成α螺旋结构的部分； X不存在或者为由长度1个~9个的氨基酸构成的部分； 螺旋Β为能够形成α螺旋结构的部分；并且 L为由长度2个~7个的氨基酸构成的部分； 蛋白质