35、T238、Uhth-104、Uhth-104、HTh74、KAT18、TTAl、FR081-2、 HTh7、C643、ΒΗΤ101和KTC-2。
[0288] -旦已测定下列方面：（i)候选基因和c-MAF基因在原发性癌肿瘤样品（诸如来自 乳腺癌肿瘤，或来自结肠癌、肺癌、肾癌或甲状腺癌肿瘤细胞，更特别地乳腺癌细胞的）中的 表达水平，和（ii)所述候选基因在一组癌细胞诸如乳腺癌、肺癌、肾癌或甲状腺癌，更特别 地乳腺癌细胞中的表达水平响应c-MAF基因的表达的调节的变化，用于鉴定用于鉴定对转 移的易感性(倾向性)的标志基因的体外方法包括
[0289] (i)原发性癌肿瘤样品中的所述基因与c-MAF基因的表达水平的比较和 [0290] (i i)响应c-MAF基因的表达的调节的表达水平与所述基因的水平的变化的比较
[0291] 在优选模型中，如果所述步骤(i)中定义的/确定的所述基因的表达与原发性肿瘤 样品中的c-MAF的水平直接相关以及如果响应c-MAF基因的表达的调节的表达水平的变化 与所述调节直接相关，则这表明所述基因的升高的水平表示对转移的倾向性。
[0292] 在另一个优选模型中，如果步骤（i)中测定的所述基因的表达与原发性肿瘤样品 中的c-MAF的水平直接相关以及如果响应c-MAF基因的表达的调节的表达水平的变化与所 述调节负相关，则这表明所述基因的降低的水平表示对转移的倾向性。
[0293]通过两个基因的表达水平与参照值的比较来产生候选基因的表达与原发性肿瘤 样品中的c -MAF的表达之间的相关性，其中如果两个基因都在相同样品中显示它们的表达 相对参照值的变化，则认为在两个基因的表达之间存在相关性。所述相关性可以是直接的 (候选基因的表达相对于参照值的增加与c-MAF的表达相对所述基因的参照值的增加相关， 或候选基因的表达相对参照值的减少与c - M A F基因的表达相对所述基因的参照值的减少 相)或相反的（候选基因的表达相对于参照值的增加与c-MAF的表达相对于所述基因的参照 值减少相关，或候选基因的表达相对于参照值的减少与c-MAF基因的表达相对于所述基因 的参照值的增加相关）。
[0294] 修饰基因的表达水平响应c-MAF基因的调节的变化之间的相关性，通过在诱导c- MAF基因的表达的调节之前测定所述基因的表达水平和在已产生c-MAF基因的表达的调节 之后所述基因在相同样品中的表达水平来实现，如果候选基因的表达伴随c-MAF的表达的 变化的改变已产生，则认为存在相关性。相关性可以是直接的(候选基因表达伴随增加的c- MAF表达而增加，或减少的基因表达伴随减少的c-MAF表达而减少)或相反的(候选基因表达 伴随减少的c-MAF表达而增加，或候选基因表达伴随着增加的c-MAF表达(相对于该基因的 参照值)而减少(相对于参照值））。
[0295] 当产生相对于在引入对c-MAF的表达的改变之前的水平，至少5 %、至少10 %、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、 至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80% :至少85%、至少90%、至少95%、至少 100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多的所述基因的表达 水平的升高时，认为存在伴随c-MAF的表达的变化的候选基因的表达的增加。
[0296] 当产生相对于在引入对c-MAF的表达的改变之前的水平，至少5 %、至少10 %、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、 至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80% :至少85%、至少90%、至少95%、至少 100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%或更多的所述基因的表达 水平的降低时，认为存在伴随c-MAF的表达的变化的候选基因的表达的减少。
[0297] 在优选模型中，转移是骨转移。
[0298] 本发明通过下列实施例在本文中的下文中进行了描述了，所述实施例经考虑只用 于举例说明目的，并且不限制本发明的范围。 实施例
[0299] I.材料和方法
[0300] 实验研究模型
[0301] 用于乳腺癌ER+和ER-PR-Her2-的转移的研究的新实验模型已被开发。为此目的， 使用称为MCF7的乳腺癌ER+的人细胞系，已用允许表达GFP/荧光素酶的载体以稳定形式转 染的所述乳腺癌ER+人细胞系。通过经由心室内或在或在(尾巴）尾静脉中的注射将该细胞 接种在免疫缺陷型小鼠（Balb-c/裸鼠）中以能够选择在不同器官中具有转移能力的细胞。 大鼠具有雌激素的皮下埋植剂以保证这些激素在整个实验过程中存在。
[0302] 转移群体的选择
[0303] 通过来自转移病灶的细胞的鉴定和分离选择不同组织中的转移群体。为此，使用 生物发光成像技术，其包括借助于其有可能检测不同时间上的目标器官中的肿瘤细胞的建 立和生长以及定量存在的肿瘤细胞的数目的技术。对于该技术的应用，细胞已被转导以表 达荧光素酶和GFP的基因，通过这些方法，才可能使用无创方法进行它们的体内实时监测/ 观察可。因其灵敏度水平和速度而使用Xenogen IVIS型的设备和Livingimage软件作为优 选方法来在全身麻醉下对动物进行发光图像(荧光素酶活性）的捕获。为了分离转移细胞， 切开肿瘤病灶，随后使用细胞计数技术(使用利用激活诱发的荧光(GFP)(绿色荧光蛋白）扫 描），将转移性细胞从宿主生物体的其它细胞分离出来。一旦这些细胞已被分离，重复该过 程以通过富集/供给其通过特定组织的向性。通过使用这些方法，分离了具有组织的特异性 的特定转移群体，包括骨和脑中的转移。
[0304] -旦鉴定并分离了转移群体，就进行高效转录分析。首先，该策略允许鉴定其转录 得到增强的基因，包括在具有不良预后的癌细胞的转移过程中用作介质的一些基因。通过 无偏体内选择法确认发现其表达在转移细胞于特定组织和器官中的定殖中被改变的基因 的参与。选择的具有高的定殖骨的能力的细胞群体被称为B〇M2。
[0305] 其表达与c-MAF的表达相关的基因的组的鉴定。
[0306]通过349个原发性乳腺肿瘤的全基因组转录特征谱的比较，鉴定了其表达以积极 (直接)方式与c-MAF的表达良好相关，或可选择地，以消极(相反)方式与与c-MAF的表达良 好相关的基因。通过在确定的细胞模型中分析它们相对于的c-MAF的表达的表达验证以该 方式获得的细胞。修饰MCF7ER+乳腺癌细胞系，以使它们良好地表达c-MAF基因的长的同种 型或短的同种型，并且使用Affymetrix U133A2Plus测定RNAm的表达特征谱。通过使用常规 技术，获得MCF-7骨转移细胞的衍生物，其中c-MAF被耗竭。在先前的细胞群中测定基因表达 特征谱，选择作为c-MAF的表达的函数被显著改变的那些基因。这些结果使得可能获得c- MAF在骨中的转移程序，其包括99个基因（这些基因中的76个被过表达，表1，并且33个被抑 制，表2)，所述基因的表达与原发性乳腺癌肿瘤中c-MAF的表达水平显著相关，并且其在使 用的细胞条件的至少一个条件中作为的c-MAF的函数发生变化。c-MAF在骨中的转移程序包 括细胞因子、细胞粘附分子、锚定于膜的蛋白酶、信号转导介质和转录因子。
[0307]将该组基因（其中观察到在ER+乳腺癌细胞中的表达水平的变化)经历验证。为此， 将候选基因的表达水平与使用原发性乳腺癌肿瘤和转移组群获得的基因表达的特征谱相 比较，所述肿瘤和转移组群包括560个原发性乳腺癌肿瘤和46个来自乳腺癌患者的转移细 胞。
[0308] 生物信息学和计算生物学
[0309]为了获得转移中富含有的基因的组和验证它们的临床相关性，使用R统计包和 B i 〇 c ο n d u c t 〇 r。输入用于数据处理的特定函数和结构并且将其对开放以在网站 www .bioconductor.org 上可公共访问。
[0310] 实施例1
[0311] 相关基因的选择
[0312] 进行分析，其目的是选择在来源于单一 R+乳腺癌细胞系中响应C-MAF的表达水平 的变化以不同方式表达的基因（表1，图1B)。按照下列标准选择对由c-MAF介导的骨转移程 序是决定性的基因和功能：
[0313] i)其在原发性肿瘤中的表达与c-MAF的表达显著相关的基因。
[0314] i i) c-MAF在MCF7细胞中过表达(长或短的同种型）时，或当c-MAF在表达c-MAF的来 源于表达MCF7的高度转移的骨细胞中的表达降低时，其表达被c-MAF的表达改变的基因，和
[0315] i i i)与原发性肿瘤中和i i)中提及的细胞条件之一中的MAF的表达相关的基因被 认为是由c-MAF介导的骨转移程序的成员。
[0316] 基于这些标准，其表达水平与c-MAF的表达水平相关的基因被鉴定，并且测定了其 在表达水平上的变化是如何与ER+原发性乳腺癌肿瘤的c-MAF的表达相关的(表1)。
[0317] 实施例2:
[0318] 针对骨转移的发展富集的基因的治疗值和预后值.
[0319] 相对含有来自乳腺癌患者的560个原发性乳腺癌肿瘤和58个转移的表达特征谱和 临床记录的两个不同数据库，评价通过此处开发的用于转移细胞群的选择的实验系统在骨 转移中富集的基因。这些肿瘤代表所有亚型的乳腺癌和转移的定位。两个数据库和相关临 床记录对于公众都是可获得的(GSE 2603、2034、12276和14020)。
[0320]获自骨转移的基因在ER+原发性肿瘤中的基因表达显示与骨中的复发的显著相关 性，并且还与至骨的转移相关（图1A)但与至其它组织的转移无关（图1B)。
[0321] 实施例3
[0322] 由c-MAF :PTHLH基因介导的骨转移的程序的成员的体内功能验证
[0323] 在小鼠中，在乳腺癌转移的异种移植物实验模型中于骨中的转移定殖试验中，功 能性验证在先前的分析中呈阳性并且与c-MAF的表达直接相关的转移PTHLH基因（表1和图 3)。验证指导转移过程的候选基因的标准逼近/接近是在表达c-MAF的低转移细胞中丢失 PTHLH功能的样品。在于体内在骨中是中度转移的细胞MCF7 (其呈现基因 c-MAF的低表达水 平）中诱导c-MAF基因的表达。c-MAF的过表达是造成PTHLH基因的内源水平升高的原因（图 3)。在本说明书，随后使用拮抗性肽阻断细胞因子PTHLH的活性(图3)。
[0324] 在用于基因转导的方法中，将慢病毒系统用于感染肿瘤细胞和将候选基因的表达 引入肿瘤细胞。使用包括贲门内接种于小鼠中的转移细胞的生物发光成像的监测技术测定 促进c-MAF基因及其效应子PTHLH的转移的功能。在所有情况下，将用空的慢病毒载体感染 的对应对照细胞注射进免疫缺陷型大鼠中的平行组群以进行比较目的。（图3)。评价骨溶性 病变形成的能力，同样地在体内评价转移病灶中的破骨细胞的分化和PTHLH在该过程中的 原因性功能（图3)。
[0325]功能获得实验以及与临床相关性相关的数据使得可能功能性地验证PTHLH作为预 后标志物和有效地导致ER+乳腺癌病例的骨转移过程的靶基因和由c-MAF基因介导的骨转 移程序的部分的作用。
[0326] 实施例4
[0327] 由c-MAF基因介导的骨转移程序的成员:RERG基因的体内功能验证
[0328] 转移抑制基因 RERG参与增殖。进行的先前分析显示RERG基因的表达与c-MAF的表 达反相关(表2和图2)。在大鼠中，于乳腺癌的异种移植物实验模型中在于骨中的转移定殖 试验中功能性验证RERG基因。
[0329] 通过在高度转移细胞中进行功能获得试验来验证RERG基因参与转移。诱导RERG在 体内选择的骨中的高度转移细胞B〇M2 (所述细胞呈现升高的负责RERG的内源水平的抑制的 c-MAF基因的表达水平）中的表达(图2)。
[0330]在基因转移过程中，使用慢病毒系统以感染肿瘤细胞并将修饰基因的表达引入肿 瘤细胞。通过使用生物发光成像技术监测贲门内接种在小鼠中的转移细胞来测定EGRG的抑 制的促进转移的功能。在所有情况下，出于比较目的，利用空的慢病毒载体感染的对应的对 照细胞注射进免疫缺陷型大鼠的平行组群中。（图2KC-MAF的丢失与更大的RERG表达和转 移细胞的增殖的减少相关。（图2) AERG在对骨是高度转移的细胞(B〇M2)(所述细胞表达高 水平的c-MAF)中的过表达导致这些细胞定殖骨的能力下降（图2)。该下降伴随如通过标志 物Ki-67测量的增殖速率的减小（图2)。
[0331] c-MAF过表达背景中的功能获得实验以及与临床相关性相关的数据，使得可能功 能性验证RERG作为预后标志物和有效地导致ER+乳腺癌病例的骨转移过程的靶基因以及由 c-MAF基因介导的骨转移程序的部分的作用。
[0332] 实施例5
[0333] 由c-MAF介导的骨转移程序的成员:P0DXL基因的体内功能性验证
[0334] 在基于来自小鼠的纯化的骨髓细胞的实验模型中，在至来源于骨髓的细胞的附着 的试验中功能性验证在先前的分析中是积极的并且与c-MAF的表达直接相关(表1和图4)的 P0DXL转移基因。该附着过程对于骨细胞是特异的，只要如果使用内皮细胞或来自肺的细胞 外基质(获自血管系统）的蛋白重复其时，恰恰相反，既没有观察到在P0DXL存在的情况下更 大的附着也没有观察到高水平的c-MAF(图4)。验证候选基因指导转移过程的标准逼近是高 度转移细胞中（骨细胞或内皮细胞中）的功能丢失试验。P0DXL基因的表达在体内在骨中于 高度转移细胞MCF7 (呈现高水平的负责P0DXL基因的内源水平的升高的c-MAF基因的表达） 中减少。
[0335] 在干扰RNA的转导过程中，使用感染肿瘤细胞并将RNAi候选物的表达引入肿瘤细 胞的慢病毒系统。通过对一层内皮细胞或来源于骨髓的细胞上的转移细胞应用荧光成像技 术(技术)来测定P0DXL基因的促进转移的功能。在所有情况下，出于比较目的，使用用空的 慢病毒载体感染的对应的对照细胞。（图4)。使用两种肽RGES和RGDS(所述第一种肽不结合 于整联蛋白，然而第二种肽与这类整联蛋白竞争并且阻止细胞附着)评价该过程是否与整 联蛋白的活性相关。总之，P0DXL在该过程中的原因性功能潜在地通过经由整联蛋白的相互 作用得以验证(图4)。
[0336]与功能丢失相关的实验以及相关数据允许功能性验证PODXL作为预后标志物和有 效地导致ER+乳腺癌至骨中的转移的靶基因以及由c-MAF基因介导的骨转移程序的部分的 作用。
[0337] 氺氺氺
[0338] 来自序列的术语"序列表"和"人工序列"分别被翻译为"序列表"和"人工序列"。
【主权项】
1. 预测受试者的乳腺癌转移的体外方法，其包括测定一个或多个基因在获自所述受试 者的肿瘤组织的样品中的表达水平，所述基因的表达响应于C-MAF在所述肿瘤中的表达水 平的升高而被调节，其中所述一个或多个基因相对于参照值的改变的表达水平表示转移发 生的尚风险。2. 权利要求1的方法，其中所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的一 个或多个基因选自表1中收录的基因和表2中显示的基因，并且其中所述一个或多个基因的 表达水平的调节是表1中收录的一个或多个基因的表达的增加和/或表2中显示的一个或多 个基因的表达的减少。3. 权利要求2的方法，其中所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的基 因选自PTHLH、PODXL和RERG。4. 设计用于患有乳腺癌的受试者的个体化疗法的体外方法，其包括测定一个或多个基 因在获自所述受试者的肿瘤组织中的表达水平，所述基因的表达响应于c-MAF的表达水平 的升高而被调节，其中所述一个或多个基因相对于参照值的改变的表达水平表示所述受试 者适于接受用于预防转移的治疗。5. 权利要求4的方法，其中所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的一 个或多个基因选自表1中收录的一个或多个基因和/或表2中显示的一个或多个基因，并且 其中来自表1中的一个或多个基因的表达水平的调节代表表达的增加和/或其中来自表2的 一个或多个基因的表达水平的调节代表表达的减少。6. 权利要求5的方法，其中所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的基 因选自PTHLH、PODXL和RERG。7. 权利要求1-6任一项的方法，其中所述乳腺癌选自ER+癌和三阴性癌。8. 权利要求1至7的任一项的方法，其中所述转移是骨转移。9. 权利要求8的方法，其中所述骨转移是溶骨性转移。10. 权利要求1至9的任一项的方法，其中在所述基因的RNAm的表达水平的测定过程中 进行/发生所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的一个或多个基因的表 达水平的测定。11. 权利要求1至9的任一项的方法，其中在由所述基因编码的多肽的表达水平的测定 过程中进行所述的其表达响应于c-MAF的表达水平的升高而被调节的一个或多个基因的表 达的测定。12. 抑制基因的表达或所述基因的表达产物的活性的试剂用于制备药剂的用途，所述 药剂用于治疗和/或预防乳腺癌的转移，其中所述基因在乳腺癌肿瘤细胞中的表达响应于 所述细胞中的c-MAF的表达水平的升高而增加或响应于所述细胞中的c-MAF的表达水平的 降低而减少。13. 权利要求12的用途，其中抑制基因的表达的试剂选自对于所述基因特异性的 RNAip、对于所述基因特异性的反义寡核苷酸、对于所述基因特异性的核酶，或其中抑制所 述基因的表达产物的活性的试剂选自对于所述表达产物特异性的抑制性抗体、所述表达产 物的显性阴性变体和来自所述表达产物的抑制性肽。14. 权利要求12或13的用途，其中所述的其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF的表达水平 的升高而增加的基因或其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF的表达水平的降低而减少的基因 选自表1中描述的基因。15. 权利要求14的用途，其中所述的其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF的表达水平的升 高而增加的基因是PHTLH基因或PODXL基因。16. 刺激基因的表达或所述基因的表达产物的活性的试剂用于制备药剂的用途，所述 药剂用于治疗和/或预防乳腺癌的转移，其中所述基因在乳腺癌肿瘤细胞中的表达响应于 所述细胞中的c-MAF的表达水平的升高而减少或其表达响应于所述细胞中的c-MAF表达水 平的降低而增加。17. 权利要求16的用途，其中刺激所述基因的表达的试剂是含有所述基因的编码序列 的多核苷酸，或其中刺激所述基因产物的活性的试剂是由所述基因编码的多肽。18. 权利要求17的用途，其中所述的其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF表达水平的升高 而减少或其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF表达水平的降低而增加的基因选自表2中描述 的基因。19. 权利要求18的用途，其中所述的其表达响应于乳腺肿瘤中的c-MAF表达水平的升高 而减少的基因是RERG基因。20. 权利要求12至19的任一项的用途，其中所述乳腺癌选自ER+癌和二阴性癌。21. 权利要求12至20任一项的用途，其中转移是骨转移。22. 权利要求21的用途，其中所述骨转移是溶骨性转移。23. -种体外方法，其用于鉴定患有乳腺癌的受试者对转移的倾向性的基因标志物，所 述方法包括： (i) 测定原发性乳腺癌肿瘤样品中的候选基因和c-MAF的表达水平，和 (ii) 测定所述基因在乳腺癌细胞群体中的表达水平响应于c-MAF基因的表达的调节的 变化； 其中如果所述基因的表达水平与原发性乳腺癌肿瘤样品中的c-MAF的表达在统计上显 著相关并且响应于c-MAF基因表达的调节的表达水平的变化与所述基因的水平的变化在统 计上显著相关，则表明所述基因是受试者对转移的倾向性的标志物。24. 权利要求23的方法，其中步骤(i)中测定的给定的基因的表达与原发性肿瘤样品中 的c-MAF水平直接相关并且如果响应于c-MAF基因表达的调节的表达水平的变化与所述调 节直接相关，则表明所述基因的高水平表示对转移的倾向性。25. 权利要求23的方法，其中步骤(i)中测定的给定基因的表达与原发性肿瘤样品中的 c-MAF的水平反相关并且如果响应于c-MAF基因表达的调节的表达水平的变化与所述调节 反相关，则表明所述基因的下降的水平表示对转移的倾向性。26. 权利要求23至25的任一项的方法，其中c-MAF表达的调节是表达的增加。27. 权利要求26的方法，其中表达的增加通过在细胞群体中表达c-MAF的短的同种型 和/或长的同种型来进行。28. 权利要求23至25的任一项的方法，其中c-MAF表达水平的调节是表达的减少。29. 权利要求28的方法，其中所述c-MAF的短的同种型和/或c-MAF的长的同种型的表达 减少。30. 权利要求23至29的任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞和/或原发性肿瘤是ER+或 三阴性的。31. 权利要求23至30的任一项的方法，其中所述转移是骨转移。32. 权利要求23至31的任一项的方法，其中所述乳腺癌细胞选自已经建立的细胞系。33. 权利要求32的方法，所述已经建立的细胞系是MCF7品系。
【专利摘要】本研究，除了设计患有癌症，特别地乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和甲状腺癌的受试者的定制疗法以外，还描述了基于其表达受c-MAF表达的升高调节的一个或多个基因的表达水平的测定来测定患有癌症的受试者发生转移的可能性的方法。其还描述了用于基于诱导c-MAF表达的调节鉴定具有对转移癌的倾向的标志基因的方法，和最终PTHLH和PODXL抑制剂以及RERG激活剂在治疗和/或预防癌症，特别地乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和甲状腺癌中的用途。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105431548
【申请号】CN201480015519
【发明人】R·戈米斯, A·阿诺尔, M·塔拉戈纳, M·帕夫罗维奇, E·普拉尼特
【申请人】生物医学研究机构基金会, 卡塔兰研究和高级研究院
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2903306A1, EP2975138A2, US20140314792, US20160040247, WO2014140896A2, WO2014140896A3