制备有机化合物的方法

制备有机化合物的方法
【专利说明】经由作为中间产物的乙酿乙酿辅酶A由氢氧气和0)2制备有机 化合物的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于制备有机化合物的方法，所述方法包括以下方法步骤： A) 在含水培养基中提供氢氧化细菌(Knallgasbakterium)，所述氢氧化细菌与其野生 型相比具有增加的酶Εχ的活性，所述酶够催化2个乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A和辅酶A 的转化 B) 使所述含水培养基与气体接触，所述气体含有重量比为20-70 :10-45 : 5-35的H2、 C〇2和〇2,和任选地 C) 纯化所述有机化合物。
【背景技术】
[0002] 基于生物的燃料和化学品目前通常由碳水化合物例如葡萄糖、右旋糖或甘油制 备。这具有多个缺点： i)碳水化合物例如葡萄糖、右旋糖或甘油的价格可能与化石原料类似地发展，因为它 们可以转化成具有高燃烧值的产物。 i i)碳水化合物例如葡萄糖、右旋糖或甘油处于强烈价格波动。 iii) 碳水化合物例如葡萄糖、右旋糖或甘油不可在所有区域以足够的量作为原料得 到。 iv) 碳水化合物例如葡萄糖或右旋糖作为发酵原料的应用与作为食品的应用竞争。
[0003] 在能源方面有利的好氧条件下借助于生物催化剂和使用出和0)2作为原料高选择 性地制备有机化合物的技术目前仍不可得到，但是使得在原料技术和高区域灵活性方面由 成本有利的原料或废物流(天然气、城市垃圾、生物质、转炉气体等)制备这些化学物质成为 可能。

【发明内容】

[0004] 已经令人惊奇地发现，在下文中描述的方法能够克服现有技术缺点的至少一个。
[0005] 因此，本发明提供了在权利要求1中和在其从属权利要求中描述的方法。
[0006] 本发明还提供了在本发明的上下文中公开的氢氧化细菌用于制备有机化合物的 用途。
[0007] 因此，本发明提供了用于制备有机化合物的方法，所述方法包括以下方法步骤： A) 在含水培养基中提供氢氧化细菌，所述氢氧化细菌与其野生型相比具有增加的酶 Ei的活性，所述酶够催化2个乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A和辅酶A的转化 B) 使所述含水培养基与气体接触，所述气体含有重量比为20-70:10-45:5-35、特别是 30-55:15-40:10-30 的 H2XO2 和 〇2，和任选地 C) 纯化所述有机化合物。
[0008] 术语"氢氧化细菌"应当被理解为是指这样的细菌:其能够化能自养生长，且能够 在氧气存在下由出和〇)2构建具有超过一个碳原子的碳骨架，其中氢气被氧化且氧气被用作 末端电子受体。根据本发明，其可用作天然地来自氢氧化细菌的那些细菌或者已经通过基 因技术修饰而变成氢氧化细菌的细菌，例如大肠杆菌细胞，其由于必要酶的重组插入，已经 能够在氧气存在下由出和(：02构建具有超过一个碳原子的碳骨架，其中氢气被氧化且氧气被 用作末端电子受体。优选地，在根据本发明的方法中使用的氢氧化细菌是作为野生型已经 是氢氧化细菌的那些。
[0009] 根据本发明优选地使用的氢氧化细菌选自以下属:无色杆菌属(Achromobacter)、 酸硫杆菌属(八(^(1；^11；!_(^3(3；!_11118)、食酸菌属(八(^(1〇￥0以1)、产碱菌属(八1〇311861168)、太湖 念珠藻属（八11&6611&)、产液菌属（八9111￡61)、节杆菌属（八1^111'〇6&(^61')、固氮螺菌属 (Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium)、贪铜菌属 (Cupriavidus)、德克斯氏菌属（Derxia)、螺杆菌属（Helicobacter)、草螺菌属 (!^1^&8卩；!_1'；!_1111111)、氢杆菌属（取(11'〇8611(^&(^61')、取(11'〇8611(^&。11111111、卩麓氢菌属 (Hydrogenophaga)、嗜氣菌属（Hydrogenophilus )、Hydrogenothermus、Hydrogeno vibrio、 艾德昂菌属01种（Ideonella sp. 01)、Kyrpidia、生金球菌属(Metallosphaera)、甲焼短 杆菌属(]^丨1^11〇1^6￥；^3(^61')、分枝杆菌属(]\^(^3(^61'；!_11111)、诺卡氏菌属(?^0〇3『(113)、寡养 菌属（01 igotropha)、副球菌属（Paracoccus)、Pelomonas、Polaromonas、假单胞菌属 (Pseudomonas)、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia)、根瘤菌属（Rhizobium)、红球菌属 (Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodo spirillum)、链霉菌 属（Streptomyces)、荚硫菌属（Thiocapsa)、密螺旋体属（Treponema)、贪菌属 (Variovorax)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、沃特氏菌属(Wautersia)，其中贪铜菌属是特 别优选的， 特别地选自以下种：钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(别名富养罗尔斯通氏菌 (Ralstonia eutropha)、Wautersia eutropha、真养产喊菌（Alcaligenes eutrophus)、 真养氢单胞菌（Hydrogenomonas eutropha))、Achromobacter ruhlandii、氧化亚铁酸硫 杆菌(六(^(1;^11；!_(^&(3；!_11118€61'1'〇〇11(1&118)、敏捷食酸菌(六(^(1〇￥(^&1€&(3；!_118)、嗜氢产 喊菌（Alcaligenes hydrogenophilus)、广泛产喊菌（Alcaligenes latus)、Anabena cylindrical Anabena oscillaroides、太湖念珠藻属（Anabena sp.)、Anabena spiroides、Aquifex aeolicus、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、节杆菌属 11X菌株 (Arthrobacter strain 1IX)、施氏芽抱杆菌(Bacillus schlegelii)、大豆慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium japonicum)、钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator)、胶德克斯氏菌 (Derxia gummosa )、大肠杆菌（Escherichia coli)、幽门螺杆菌（He liobacter pylori)、自养草螺菌（Herbaspirill u m autotrophicum)、 Hydrogenobacterhydrogenophilus、嗜热氣杆菌（Hydrogenobacter thermophi lus)、 Hydrogenobaculum acidophilum、黄色氣菌（Hydrogenophaga f lava)、苍白氣菌 (Hydrogenophaga palleronii)、类黄色氣菌（Hydrogenophaga pseudof lava)、 Hydrogenophaga taeniospiralis、Hydrogeneophilus thermoluteolus、 Hydrogen。thermus mar inus、海洋氢弧菌（Hydrogenovibrio mar inus)、艾德昂菌属0-1 种（Ideonella sp. 0-1)、Kyrpidia tusciae、勤奋生金球菌（Metallosphaera sedula)、Methanobre vibactercuticular is、戈登分枝杆菌（My cobacterium gordonae)、 自养诺卡氏菌（Nocardia autotrophica)、01igotropha carboxidivoransNl^Mffl'Ji^lSi (Paracoccus denitrificans )、Pe1omonas saccharophi1 a、Po1aromonas hydrogenivorans、·氢假单胞菌（Pseudomonas hydrogenovora)、嗜热假单胞菌 (Pseudomonas thermophi la)、日本根瘤菌（Rhizobium japonicum)、混池红球菌 (Rhodococcus opacus)、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris)、氢碳酸塞里 伯氏菌（Seliberia carboxydohydrogena)、热自养链霉菌（Streptomyces thermoautotrophicus )、桃红英硫菌（Thiocapsa roseopersicina)、Treponema primitia^^i^^RM iSfCVariovorax paradoxus)、Xanthobacter autrophicus、黄黄色杆 菌（Xanthobacter flavus), 特别地选自菌株钩虫贪铜菌H16、钩虫贪铜菌HI或钩虫贪铜菌Z-l。
[0010] 根据本发明的方法的氢氧化细菌与其野生型相比具有增加的酶扮的活性。
[0011] 细胞的"野生型"在这里表示这样的细胞:其基因组以通过进化天然地产生的状态 存在。该术语用于全细胞和单个基因。因此，术语"野生型"特别地不包括这样的细胞或基 因：其基因序列已经借助于重组方法至少部分地人工修饰。
[0012]在上面和在关于本发明的以下详述中使用的术语"增加的酶活性"优选地被理解 为是指，所述野生型已经以发生相应的活性增加的方式进行了基因技术修饰。优选地，该术 语应当被理解为是指增加的细胞内活性。
[0013] 关于细胞中酶活性的增加的下述详述适用于酶Ei的活性的增加，且适用于其活性 可任选地增加的下述所有酶。
[0014] 基本上，通过增加编码酶的（一种或多种)基因序列的拷贝数，通过使用强启动子， 通过改变基因的密码子选择，通过以不同的方式和方法增加 mRNA或酶的半衰期，通过修饰 基因的表达的调节，或通过使用编码具有增加的活性的对应酶的基因或等位基因，和任选 地通过组合这些措施，可以实现酶活性的增加。例如，通过用含有期望的基因、该基因的等 位基因或其部分和使该基因能被表达的启动子的载体的转化、转导、缀合或这些方法的组 合，产生根据本发明使用的基因技术修饰的微生物。特别地，通过将基因或等位基因整合进 细胞的染色体或在染色体外复制的载体中，实现异源表达。
[0015] 以丙酮酸羧化酶为例关于增加细胞中的酶活性的可能性的概要存在于DE-A-100 31 999中，其特此通过引用并入，且其公开内容形成本发明的公开内容关于增加细胞中的 酶活性的可能性的部分。
[0016] 上面详细说明的酶或基因和下面详细说明的所有酶或基因的表达可借助于1-维 和2-维蛋白凝胶分离并随后使用适当的评价软件光学地鉴别凝胶中的蛋白浓度来检测。
[0017] 如果酶活性的增加排它地基于对应基因的表达的增加，通过对比野生型和基因技 术修饰的细胞之间的1 -维或2-维蛋白分离可以以简单方式定量所述酶活性的增加。在细菌 的情况下制备蛋白凝胶和鉴别所述蛋白的常规方法是Hermann等人(Electrophoresis， 22: 1712-23 (2001))描绘的操作方式。同样可以如下分析蛋白浓度:使用对要检测的蛋白 特异性的抗体进行蛋白质印迹杂交(Sambrook等人，Molecular Cloning: a laboratory manual,第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)，随后使用用于确定浓度的适当软件进行光学评价(Lohaus和Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999)， Angewandte Chemie 111: 2630-2647)。
[0018] 当由要确定的酶活性催化的反应的可能产物可以在微生物中快速代谢或者在野 生型本身中的活性过低而不能借助产物形成充分确定要确定的酶活性时，该方法也总是适 用的。
[0019] 酶E1(它的活性在氢氧化细菌中与其野生型相比增加)优选地选自来自酶类别EC 2.3.1.9的乙酰辅酶A:乙酰辅酶A C-乙酰转移酶。
[0020] 与本发明关联地引用的登录号对应于日期为2012年6月26日的NCBI蛋白库数据库 登记项;通常在该情况下，登记项的版本编号用"数字"例如"Γ来鉴别。
[0021] 根据本发明优选的乙酰辅酶A:乙酰辅酶A C-乙酰转移酶选自列表 AAC26023·1、ABR35750·1和ABR25255·1， 以及 具有如下多肽序列的蛋白，在所述多肽序列中，相对于前述参照序列通过缺失、插入、 置换或它们的组合修饰了氨基酸残基的至多60%、优选至多25%、特别优选至多15%、特别是 至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%，且所述蛋白仍然具有包含对应的前述参照序列的 蛋白的活性的至少50%、优选65%、特别优选80%、特别是超过90%，其中所述参照蛋白的100% 活性被理解为是指，与所述参照蛋白不存在时生物催化剂的活性相比，用作生物催化剂的 细胞的活性的增加，即基于使用的细胞量计每单位时间转化的物质量(单位/克细胞干重 [U/g CDW])，其中在这方面的活性被理解为是指两个乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A和辅酶A 的转化。
[0022] 用于确定所述活性的方法描述在Middleton等人.The Biochemical journal (1972)，126(1)，27-34中。
[0023] 在方法步骤A)中在含水培养基中提供氢氧化细菌。使用的含水培养基必须适当地 满足各种菌株的需要。在美国细菌学学会(American Society for Bacteriology)的手 册"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C. , USA, 1981)中含有各种微生物的培养基的描述。
[0024] 所述培养基可以含有氮源;使用的氮源可以是有机含氮的化合物例如蛋白胨、酵 母浸出物、肉膏、麦芽浸出物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷 酸铵、碳酸铵和硝酸铵、氨、氢氧化铵或氨水。所述氮源可以单独使用或作为混合物使用。
[0025] 所述培养基可以含有磷源;使用的磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或 对应的含钠盐。
[0026] 所述培养基还可以含有碳源，尽管它们应当受到限制，因为氢氧化细菌基本上依 赖于例如存在于包含H2、C02和02的气体中的含碳气体。
[0027] 此外，所述培养基必须含有金属的盐，例如，生长必需的硫酸镁或硫酸铁。最后，除 了上述的物质以外，可以使用必需的生长物质例如氨基酸和维生素。此外，可以将合适的前 体加入所述培养基中。可以将前述原料以单批形式加给培养物，或在培养过程中适当地补 料。
[0028]为了控制培养物的pH，适当地使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨 水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫的产生，可使用消泡剂例如脂肪酸聚二醇 酯。为了维持质粒的稳定性，可向培养基中加入合适的选择性物质例如抗生素。
[0029]在方法步骤B)中，使所述含水培养基与含有H2、C02和02的气体接触。
[0030]由此，向所述氢氧化细菌提供含有h2、c〇2和〇2的气体作为碳源。所述氢氧化细菌至 少部分地由该碳源合成乙酰乙酰辅酶A，所述乙酰乙酰辅酶A被代谢成其它有机化合物。与 在产乙酸菌工艺方法(其在严格厌氧条件下进行）中不同，本发明的方法的方法步骤B)在好 氧条件下进行。
[0031 ] 含有H2、C〇2和〇2的气体中的氢气的分压优选地是0.1-100巴，优选0.2-10巴，特别 优选0.5-4巴。
[0032] 含有H2、C02和02的气体中的二氧化碳的分压优选地是0.03-100巴，特别优选0.05- 1巴，特别是0.05-0.3巴。
[0033] 含有H2、C〇2和〇2的气体中的氧气的分压优选地是0.001-100巴，特别优选0.04-1 巴，特别是0.04-0.5巴。
[0034] 合成气特别适合作为方法步骤B)中的出和0)2的来源，其与氧气混合着使用；因此， 根据本发明，优选的是方法步骤B)中的气体含有合成气。
[0035] 合成气可以例如由碳气化的副产物提供。所以，所述氢氧化细菌将作为废产物的 物质转化成有价值的原料。
[0036] 可替换地，通过广泛可得到的、价格便宜的农业原料的气化，可以提供用于本发明 的方法的合成气。存在众多可以转化成合成气的原料的实例，因为几乎所有植物形式可以 用于该目的。优选的原料选自多年生草例如芒草、谷类残余物、加工废物例如锯肩。一般而 言，在气化设备中从经干燥的生物质得到合成气，主要通过热解、部分氧化和蒸汽转化，其 中主要产物是C0、H2和C02。
[0037] 通常，加工产物气体的一部分，以便优化产物收益和避免焦油形成。使用石灰和/ 或白云石，可以使不希望的焦油裂化为合成气和C0。这些方法详细地描述在例如Reed， 1981 (Reed , T.B., 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ·)。也可能使用不同来源的混合物用于产生合 成气。
[0038] 特别优选是，在方法步骤B)中合成气中所含的碳占在方法步骤B)中氢氧化细菌可 利用的所有碳源的碳的至少50重量％、优选至少70重量％、特别优选至少90重量％，其中所述 碳的重量百分比是基于碳原子。剩余的碳源可以例如以碳水化合物的形式存在于含水培养 基中，或者是来自合成气以外的来源的C02。
[0039] 其它C02来源是废气，例如烟气、炼油厂废气、通过酵母发酵或梭状芽胞杆菌发酵 形成的气体、来自含纤维素的材料的气化或碳气化的废气。
[0040] 这些废气不一定必须作为其它方法的次要产物形成，而是可以为了用在本发明的 方法中专门制备。
[0041] 要通过本发明的方法制备的有机物质优选地选自包含3个或4个碳原子的物质，特 别是丁醇、丁烯、丙烯、丁酸、丙酮、2-羟基异丁酸和2-丙醇和2-羟基异丁酸。
[0042]第一实施方案:丁醇 本发明的方法的第一实施方案的特征在于，所述有机物质是丁醇，ΕΗΛ选地选自乙酰 辅酶Α:乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，且所述氢氧化细菌优选地与其野生型相比具有增加的酶 E2的活性，所述酶E2能够催化乙酰乙酰辅酶A和NADH或NADPH向3-羟基丁酰辅酶A和NAD+或 NADP+的转化。
[0043] 酶E2优选地选自来自酶类别EC: 1.1.1.157的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶。
[0044] 根据本发明优选的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶选自列表 ΝΡ_349314·1、ΥΡ_001307469·1和CAQ53138.1， 以及具有如下多肽序列的蛋白，在所述多肽序列中，相对于前述参照序列通过缺失、插 入、置换或它们的组合修饰了氨基酸残基的至多60%、优选至多25%、特别优选至多15%、特别 是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%，且所述蛋白仍然具有包含对应的前述参照序列 的蛋白的活性的至少50%、优选65%、特别优选80%、特别是超过90%，其中所述参照蛋白的 100%活性被理解为是指，与所述参照蛋白不存在时生物催化剂的活性相比，用作生物催化 剂的细胞的活性的增加，即基于使用的细胞量计每单位时间转化的物质量(单位/克细胞干 重[U/g CDW])，其中在这方面和关于酶扮活性确定的活性通常被理解为特别是指乙酰乙酰 辅酶A和NADH向3-羟基丁酰辅酶A和NAD+的转化。
[0045] 用于确定所述活性的方法描述在Senior等人.Biochemical Journal (1973)， 134(1), 225-38〇
[0046] 本发明的方法的一个优选的第一实施方案的特征在于，除了增加的酶EjP任选的 E2的活性以外，所述氢氧化细菌与其野生型相比具有增加的酶E3的活性，所述酶E3能够催化 3-羟基丁酰辅酶A向巴豆酰辅酶A和水的转化。
[0047] 酶E3优选地选自来自酶类别EC: 4.2.1.55的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶。
[0048] 根据本发明优选的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶选自列表 ΝΡ_349318·1、ΥΡ_001307465·1和CAQ53134.1 以及具有如下多肽序列的蛋白，在所述多肽序列中，相对于前述参照序列通过缺失、插 入、置换或它们的组合修饰了氨基酸残基的至多60%、优选至多25%、特别优选至多15%、特别 是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%，且所述蛋白仍然具有包含对应的前述参照序列 的蛋白的活性的至少50%、优选65%、特别优选80%、特别是超过90%，其中所述参照蛋白的 100%活性被理解为是指，与所述参照蛋白不存在时生物催化剂的活性相比，用作生物催化 剂的细胞的活性的增加，即基于使用的细胞量计每单位时间转化的物质量(单位/克细胞干 重[U/g CDW])，其中在这方面和关于酶Ε3活性确定的活性通常被理解为特别是指3-羟基丁 酰辅酶Α向巴豆酰辅酶Α和水的转化。
[0049] 用于确定所述活性的方法描述在Boynton等人· Journal of bacteriology (1996)， 178(11)， 3015-24。
[0050] 本发明的方法的另一个优选的第一实施方案的特征在于，除了增加的酶E1和任选 的E#P/或E3的活性以外，所述氢氧化细菌与其野生型相比具有增加的酶E4活性，所述酶E 4能够催化巴豆酰辅酶A和NADH或NADPH向丁酰辅酶A和NAD+或NADP+的转化。
[0051 ] 酶E4优选地选自来自酶类别EC: 1.3.99.2的丁酰辅酶A脱氢酶。
[0052]根据本发明优选的丁酰辅酶A脱氢酶选自列表 ΝΡ_349317·1、ΥΡ_001307466·1和CAQ53135·1 以及具有如下多肽序列的蛋白，在所述多肽序列中，相对于前述参照序列通过缺失、插 入、置换或它们的组合修饰了氨基酸残基的至多60%、优选至多25%、特别优选至多15%、特别 是至多10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%，且所述蛋白仍然具有包含对应的前述参照序列 的蛋白的活性的至少50%、优选65%、特别优选80%、特别是超过90%，其中所述参照蛋白的 100%活性被理解为是指，与所述参照蛋白不存在时生物催化剂的活性相比，用作生物催化 剂的细胞的活性的增加，即基于使用的细胞量计每单位时间转化的物质量(单位/克细胞干 重[u/g CDW])，其中在这方面和关于酶E4活性确定的活性通常被理解为特别是指巴豆酰辅 酶A和NADH向丁酰辅酶A和NAD+的转化。
[0053] 用于确定所述活性的方法描述在R. Graf, Ulm大学毕业论文20