/T 3497-2013行业标准。
[0018]本发明建立的LAMP检测棘颚口线虫的方法具有灵敏度高、特异性好、方便、快速等优点，不依赖于复杂的仪器和专业的人员，只需要一个恒温水浴锅，30分钟便可完成反应，拥有多种判读方法，最简便的方法是根据显色液的颜色变化便可判读结果；同时也可以用实时荧光的方法对扩增过程进行及时判读，在保证高敏感性的同时，使结果数据化、形象化，具有广泛的实用性和良好的应用前景，特别适合于基层的推广。
[0019]同时由于虫体过小而导致提取DNA量不足，样品中含有抑制因子或者操作不当，经常出现假阴性。根据棘颚口线虫ITS2基因设计检测基因，可检测棘颚口线虫;根据28S基因设计质控基因，可鉴别颚口线虫属线虫，同时依据形态学鉴定到颚口线虫属，可作为质控基因。本发明设计的质控基因，可有效防止假阴性的出现，对于棘颚口线虫的检疫防控具有重要意义。
[0020]与现有技术相比，本发明有益效果在于:本发明具有快速高效、操作便捷、高特异性、高灵敏度、鉴定简单、成本低、不需要昂贵仪器、适合现场检测等有益效果，更重要是该方法提高检测的准确性，可有效防止因样品中抑制因子和操作原因导致的假阴性检测结果的发生。
[0021 ] (I)快速高效:整个扩增只用30?45min即可完成，扩增产量可达19?1iq个拷贝；
(2)操作便捷:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性:本发明根据棘颚口线虫ITS2基因设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)尚灵敏度:最低检测极限可达到lfg/μ?；
(5)鉴定简单:可通过观察扩增曲线判或者显色液颜色变化断扩增与否，适合现场检测。
[0022](6)提高检测的准确性:内含质控引物组，可根据检测质控引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，有效预防因操作等原因造成假阴性检测结果的情况发生，提高检测的准确性。
【附图说明】
[0023]图1为棘颚口线虫ITS2基因灵敏度图。
[0024]图2为颚口线虫质控基因28S灵敏度图。
[0025]图3为棘颚口线虫ITS2基因最低检出限重复性图。
[0026]图4为颚口线虫质控基因28S最低检出限重复性图。
[0027]图5为棘颚口线虫ITS2基因特异性实验。
[0028]图6为颚口线虫质控基因28S特异性实验。
[0029]图7为实际样品检测；其中，样品I为无抑制因子的实际样品，样品2为含有EDTA抑制因子的实际样品。
【具体实施方式】
[0030]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0031 ]实施例1棘颚口线虫LAMP检测方法的建立
棘颚口线虫的LAMP检测方法，包括LAMP引物组、LAMP反应体系、LAMP检测方法。
[0032](I)LAMP引物组:以棘颚口线虫ITS2基因为靶基因、28S基因为质控基因，利用在线设计软件Primer Explorer vers1n4(http: //primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计，每个基因设计6套引物，通过引物筛选试验，得到最优引物序列如下。
[0033]ITS2基因引物序列如下:
G.Sp1-F3:CGAGAGGAGATGTCTAGCACSEQ ID NO:1);G.Sp1-B3:TCCTCGTCAAGGCGATAA(SEQ ID N0:2)；
G.Sp1-FIP:AGCATCAACATCATCGTCACCAATCTCTTATCGAGGTGCGTA(SEQ ID NO:3);
G.Sp1-BIP:TTTGTGGCAAACGTTGAGGAACAATAACGACGACATCACCG (SEQ ID NO:4);
G.Sp1-LF:GCTACCATTTCCCGACGAT(SEQ ID NO:5);
G.Sp1-LB:ACGGGGAATATCATGCTACAAA(SEQ ID NO:6)。
[0034]质控引物组根据鄂口线虫属28SrDNA设计，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示:
28S质控引物组如下所示:
Gna-F3:TGTGGAGCTGTAGCGTATACSEQ ID N0:7)；
Gna-B3:GGTACTTGTTCGCTATCGG (SEQ ID NO:8);
Gna-FIP:CTCGACCGCACAGGTCTCGATGCTCGACCGAAGTTCCSEQ ID N0:9)；
Gna-BIP:CCTTGGAGTCGGGTTGCCTCTCGTGTCGATACTTAGTCTCSEQ ID NO:10)；
Gna-LF:CACCTACTTCGGACAGTGGCSEQ ID NO:11);
Gna-LB:CGAAGATGGTGGTAAACCTCACSEQ ID NO:12)。
[0035](2)棘颚口线虫的LAMP检测方法的基因扩增检测可采用实时荧光反应体系或者显色液反应体系。
[0036]检测基因扩增检测的实时荧光反应体系及条件:25μ1反应体系含有:G.Spi_F30.2μΜ， G.Sp1-B3 0.2yM，G.Sp1-FIP 1.6yM,G.Sp1-BIP 1.6yM,G.Sp1-LF 0.8yM，G.Sp1-LB0.8μΜ，8mM dNTP、10 X ThermoPo I 反应缓冲液、120mM MgS04水溶液，DNA聚合酶8U，10 X SYBRGreen I 0.5μ1，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min;
质控基因扩增实时荧光反应体系及条件:25μ1反应体系含有:Gna-F3 0.2μΜ，Gna_B3
0.2μΜ,Gna-FIP 1.6μΜ,Gna-BIP 1.6μΜ, Gna-LF 0.8μΜ, Gna-LB 0.8μΜ，8πιΜ dNTP、10XThermoPoI反应缓冲液、120mM MgS04水溶液，DNA聚合酶8U，10 X SYBR Green I 0.5μ1，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min。
[0037]检测基因扩增检测的显色液反应体系及条件:25μ1反应体系含有:G.Spi_F30.2μM， G.Sp1-B3 0.2μΜ,6.Sp1-FIP 1.6yM,G.Sp1-BIP 1.6μΜ,6.Sp1-LF 0.8μΜ,6.Sp1-LB 0.8μΜ，8mM dNTP、10 X ThermoPoI反应缓冲液、120mM MgS04水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，将Ιμ?显色液滴在反应管盖中间，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min;
质控基因扩增显色反应体系及条件:25μ1反应体系含有:Gna-F3 0.2μΜ，Gna_B3 0.2μΜ,Gna-FIP I.6μΜ，Gna-BIP 1.6μΜ, Gna-LF 0.8μΜ, Gna-LB 0.8μΜ，8πιΜ dNTP、10XThermoPoI反应缓冲液、120mM MgS04水溶液，DNA聚合酶8U，待检样品2μ1，用超纯水补齐到25μ1，加20μ1密封液;设置阳性对照和阴性对照;将配制好的反应管混匀后离心，将Ιμ?显色液滴在反应管盖中间，并于63°C反应30?45min，并在80°C持续2min。
[0038](3)棘颚口线虫的LAMP检测方法，可以使用以下结果判读方法:I)显色液反应体系:利用1000XSYBR Green I作为显色液，反应前加到反应管盖中间，反应后与反应液混匀，如果颜色变绿则为阳性；2)实时荧光反应体系:将反应管中置于ESE-Quant TubeScanner或荧光PCR仪中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果；
(4)检测基因与质控基因阳性质粒分别为含有棘颚口线虫ITS2基因部分片段和28S基因部分片段的T载体克隆，其制备方法为:以分离鉴定的棘颚口线虫基因组为模板，分别利用的ITS2引物组的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2)和28S质控引物组的外引物(SEQID N0:7和SEQ ID N0:8)进行扩增，所得ITS2基因扩增片段序列和28S基因扩增片段序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，并进行灵敏度和稳定性的测试，选择合适浓度的质粒作为阳性对照。
[0039](5)棘颚口线虫LAMP检测方法，其具体过程包括如下步骤:
S1.取虫体在显微镜下进行形态学鉴定，根据SN/T 3497-2013行业标准，判断是否为颚口线虫属线虫，使用商业化试剂盒提取基因组DNA;如果不能判断属类，也按照商业化试剂盒提取基因组DNA。
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