为18 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA;
第二种试验菌液:含亚利桑那菌浓度为17 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA;
第三种试验菌液:含亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA;
第四种试验菌液:含亚利桑那菌浓度为15 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA。
步骤2、制备含干扰菌标准菌种DNA:在六个225ml缓冲蛋白胨水(BPW，BufferedPeptone Water)中，分别添加鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌0157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌这六种干扰菌，和一个灭菌去离子水对照，分别培养18-24小时后，用灭菌生理盐水分别对每个缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB4789.2-2010方法对进行细菌计数，分别制得这六种干扰菌浓度为18 CFU/mL的干扰菌稀释液，和一个灭菌去离子水对照液，然后将这六种干扰菌稀释液和一个灭菌去离子水对照液分别取lml，采用水煮模板法或CTAB/NaCl法或QIAGEN公司试剂盒方法试剂盒方法中与步骤I相同的那一种方法，分别提取这六种干扰菌稀释液中的干扰菌标准菌DNA;
得到，
第五种干扰菌液:含鼠伤寒沙门氏菌浓度为18 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌标准菌DNA; 第六种干扰菌液:含肠炎沙门氏菌浓度为18 CFU/mL的肠炎沙门氏菌标准菌DNA;
第七种干扰菌液:含大肠杆菌0157浓度为18 CFU/mL的大肠杆菌0157标准菌DNA;
第八种干扰菌液:含福氏志贺氏菌浓度为18 CFU/mL的福氏志贺氏菌准菌DNA;
第九种干扰菌液:含单增李斯特菌浓度为18 CFU/mL的单增李斯特菌标准菌DNA;
第十种干扰菌液:含金黄色葡萄球菌浓度为18 CFU/mL的金黄色葡萄球菌标准菌DNA; 第十一种灭菌去离子水对照液:不含任何菌。
[0021 ]步骤3、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为:Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂盒，该DNA扩增试剂盒组成为:
(1)2X反应缓冲液(RM)，
(2)BstDNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase),
(3)去离子水(DW)，
(4)引物溶液DNACPM DNA)，
(5)阳性对照DNACPC DNA)ο
步骤4、用本发明的引物对步骤I和2的十一种液体分别进行LAMP法检测DNA
4.1.配制LAMP法检测液:在生物安全柜中冰上操作，向^ 个Loopamp ? “朗报? ”反应试管中分别加入下述各原料:
加入12.5yL的2 X反应缓冲液(RM)，
加入6.5yL去离子水(DW)，
加入0.5yL的引物F3，
加入0.5yL的引物B3，
加入0.5yL的引物FIP，
加入0.5yL的引物BIP，
加入1.0yL的Bst DNA聚合酶；
得到装有LAMP法检测液各原料的十一个反应试管；
所述的引物为:
弓 I 物F3: AGCAGTTCCGCCGTCG；
引物B3: TACGGCAGCAGGGTCG ；
引物 FIP: CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG ；
引物 BIP: GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。
[0022]4.2.配制含有被检测物的十一个反应试管:
向4.1步骤中的十一个反应试管分别加入 3.0yL第一种试验菌液，
3.0yL第二种试验菌液，
3.0yL第三种试验菌液，
3.0yL第四种试验菌液，
3.0yL第五种干扰菌液，
3.0yL第六种干扰菌液，
3.0yL第七种干扰菌液，
3.0yL第八种干扰菌液，
3.0yL第九种干扰菌液，
3.0yL第十种干扰菌液，
3.0yL第^^一种灭菌去离子水对照液；
获得
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为17 CFU/mL; 反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL;
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为15 CFU/mL;
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌0157浓度为108CFU/mL;
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108CFU/mL;
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108CFU/mL;
反应试管11;第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌。
[0023]4.3.对十一个反应试管进行反应处理
对十一个反应试管分别进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟HOOOrpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡;然后分别放入63°C恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再分别放入95°C恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应。
[0024]4.4.观察反应结果:
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为17 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为15 CFU/mL，20次重复试险，有16次白色浑浊为阳性;另4次无白色浑浊为阴性。
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌0157浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为108CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管11;第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌，20次重复试险无白色浑浊为阴性。
结论:对含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL,107 CFU/mLUO6 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，能多次重复的检测到亚利桑那菌，这些检测亚利桑那菌的试验具有可重复性，具有可靠性。
[0025]对含原有的亚利桑那菌浓度为15CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，检测亚利桑那菌的试验不具有完全可重复性，不具有可靠性。
[0026]用本发明的引物进行LAMP法检测，对浓度为18CFU/mL为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌0157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照液都分别是为阴性。说明本发明的引物能区分出鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌0157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照，可以推论本发明的引物能区分出沙门氏菌属的其它菌，能区分出肠杆菌科的其它细菌，能