一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤预后和化疗反应判断的试剂盒，特别涉及一种用于乳腺癌预 后判断的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生 中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病 率的增长速度却高出高发国家1~2个百分点。据国家癌症中必和卫生部疾病预防控制 局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示；全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性 恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42. 55/10万，城市为51. 91/10 万，农村为23. 12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。
[0003] 有效地预后判断是乳腺癌有效治疗和提高患者生存质量的关键所在，但是现有的 分期系统对乳腺癌的预后指导意义不够，尚不能很好地指导个性化用药，导致了不少病人 的治疗失败，从而降低了患者的生存质量和生存率。因此，寻找其他指导预后的检测方法或 手段对制定合适的乳腺癌个体化治疗有着非常重要的意义。
[0004] RNA包括编码蛋白的mRNA和非编码RNA，其中非编码RNA除了管家RNA，如转运 RNA、核糖体RNA、核仁RNA等W外，还存在着一大类具有多种生物学功能的RNA。例如， miRNA、siRNA、piRNA和长链非编码RNA，它们参与了 RNA的转录和翻译调控、蛋白的结构 和功能调控等过程，是近年的研究热点。其中，对miRNA来源、生成和功能已有较深入的 认识;miRNA基因是由RNA聚合酶II在核内转录生成长度可达数千个碱基的初级转录本 pri-miRNA，由化osha酶和DGCR8构成的复合物进行加工，形成长度约为70个碱基，含有两 个3'端突出的发卡结构前体pre-miRNA。被转运进胞浆后，pre-miRNA被Dicer切割并释 放出miRNA。由miRNA介导的沉默复合体RISC通过与祀基因的3'UTR上的识别序列结合， 介导祀基因 mRNA降解或翻译抑制。
[0005] miRNA参与调控了生命活动中一系列重要过程，包括细胞调亡、增殖、分化等。同样 其表达改变亦可引起人类疾病包括肿瘤等的发生。同时也由于miRNA具有高度的保守性、 时序性和组织特异性，因此郝些在肿瘤中表达发生改变的miRNA可W作为肿瘤诊断和预后 评估的标志物，同时也可作为肿瘤治疗的祀点。
[0006] 近年来研究发现了单个或一组miRNA可W作为许多肿瘤的预后标志物，比如肝癌 中miR-26a/b、肠癌中miR-21、肺癌中5个miRNA构成的signature等。送为寻找新的肿瘤 预后判断标记物提供了新的方向，日益受到人们的关注。
[0007] 在乳腺癌的预后判断中，使用单个或一组miRNA作为预后的标志物具有巨大的开 发和应用前景。然而，众所周知，组织中的miRNA种类繁多，又存在众多个体差异，导致难W 发现具有较好预后判断效果的单个或一组miRNA。送也正是鉴定和寻找肿瘤预后判断标志 物的难点所在。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌预后判断和化疗反应预测的试剂盒。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种用于乳腺癌预后判断的试剂盒，该试剂盒含有定量miRNA中的hsa-miR-205-5p、 hsa-miR-320a、hsa-miR-665、hsa-miR-188-5p 和 hsa-miR-198 表达量的试剂。
[0010] 发明人为了寻找与乳腺癌病人生存预后相关的miRNA,用COX风险回归分析得到 了训练组样本中各个miRNA与病人总生存之间的关系，找出5个与病人生存预后有明显相 关的 miRNA(miR-205，miR-320a，miR-665，miR-188-5p，miR-198)，其中 2 个 miRNA 是保护性 的，3个miRNA是风险性的。使用送个miRNA分子标签把病人区分为高风险和低风险，通过 生存分析比较两组之间的总生存，发现高风险组和低风险组之间总生存的差异有显著性。 (P = 0. 001)。
[0011] 为了验证送个结果，在检验组中，使用训练组中同样的风险评分公式计算风险评 分，然后用与训练组中同样的中位数把他们分为高风险组与低风险组，同样通过生存分析 比较两组之间的总生存，高风险组和低风险组之间总生存差异也具有统计学意义（P = 0. 004)。
[0012] 另外，在由外院样本形成的独立组中，此结果也再次得到验证，高风险和低风险组 之间总生存差异也具有统计学意义（P = 0.002)在对病人术后辅助治疗的分析中发现，术 后不需要进行辅助治疗的病人可被本申请的miRNA分子标签区分为高低风险组后，高低风 险组的生存有明显区别，高风险组总生存低于低风险组（P<〇. 001)，提示在未行辅助治疗的 病人中高风险的病人需要给予术后辅助治疗，送样将提高患者的生存时间。在已行术后辅 助化疗的病人当中，使用miRNA分子标签也可将病人区分为高低风险组，送两组的生存有 明显区别，高风险组总生存明显低于低风险组（P<〇. 001)，提示在已行辅助化疗的病人中高 风险的病人需要加强术后的辅助治疗或改用更有效的治疗方案，W提高患者的生存。
[0013] 基于此，本发明的技术方案可W有效地指导乳腺癌的临床治疗，对预后高风险的 患者提前进行适当的辅助治疗，W提高患者的生存质量，同时避免对低风险患者进行不必 要的治疗。
【附图说明】
[0014] 图1是乳腺癌miRNA的芯片扫描结果图； 图2是5个所挑选的miRNA的实时英光定量PCR结果与芯片结果的相关性分析结果 图； 图3是不同组患者根据5miRNA分子标签所计算得出的风险分数分为高风险组及低风 险组，对两组的总生存（0巧及无病生存值F巧进行Kaplan-Meier曲线分析的结果； 图4是术后病人根据5miRNA分子标签所计算得出风险分数分为高风险组及低风险组， 对两组的总生存（0巧及无病生存值F巧进行Kaplan-Meier曲线分析的结果。
【具体实施方式】
[0015] 乳腺癌预后判断相关miRNA的发现： 首先从中山大学附属肿瘤医院保存的本院422例乳腺癌石蜡切片及31例正常乳腺石 蜡切片中提取总RNA，用nano化op检测RNA浓度及质量，W备后期进行miRNA芯片试验。422 例患者被随机地分为训练组和检验组，其基本情况如表1所示。另外，为了进一步检验是否 在不同的人群中miRNA分子标签都有相同的预测能力，收集到了来自广州医科大学附属第 一医院的161例乳腺癌组织形成独立组（基本情况如表1)。
[001引表1.训练组、验证组、独立组中病例的临床资料特征
数据为平均值（标准差）or数量（％)，除非另外标明.*χ2检验或者Fisher' s精确 检验.f Student' S t 检验.
[0017] 根据milibase 18. 0数据库中的1921个人类microRNA序列，采用文献（RNA2007 ; 13:151-9)描述的原则，成功设计出1849个人的microRNA探针，然后点制芯片，采用1个 miRNA探针两个复点的点片方式，将1849个microRNA探针点制在玻片上。通过本实验室 的miRNA芯片平台，检测上述422例乳腺癌组织及31例正常乳腺组织中miRNA的表达；采 用切5红色英光素标记样本，通过单通道检测，一张 microarray检测一个样本，英光信号的 强弱表示miRNA在不同样本中的表达量的变化，如图1。
[0018] 芯片扫描结果用GenePix软件读取芯片数据，利用BRB软件将microRNA芯片的原 始值减去背景值的干扰，平均两个复点之间的数据，同时进行l〇g2的数据转换。然后利用 quantile软件进行芯片数据的标准化W用于后续的分析。首先，在训练组通过C0X风险回 归分析从芯片检测的1849个miRNA中找到20个与病人总生存有关的miRNA (如表2)，再从 中挑选出一个由5个miRNA组合的miRNA分子标签（如表3)来预测病人预后及指导治疗。
[0019] 表2. 20个与病人生存预后有关的miRNA.
*Cox风险回归分析
[0020] 为了验证芯片数据的可靠性，使用实时英光定量PCR技术进行验证。发明人选择 了 5miRNA分子标签内的2个下调miRNA化sa-miR-205-5p、hsa-miR-320a)和另外3个上调 的 miRNA 化sa-miR-665、hsa-miR-188-5p 和 hsa-miR-198)，在 62 例乳腺癌标本和 24 例正常 乳腺标