反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为17 CFU/mL;
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL;
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为15 CFU/mL;
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为18 CFU/mL; 反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌0157浓度为18 CFU/mL;
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为18 CFU/mL;
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为18 CFU/mL；
反应试管11;第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌。
4.3.对^^一个反应试管进行反应处理
对十一个反应试管分别进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟HOOOrpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡;然后分别放入63°C恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再分别放入95°C恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应。
4.4.观察反应结果:
反应试管1、第一种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管2、第二种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为17 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管3、第三种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL，20次重复试险有白色浑浊为阳性；
反应试管4、第四种试验菌液，含原有的亚利桑那菌浓度为15 CFU/mL，20次重复试险，有16次白色浑浊为阳性;另4次无白色浑浊为阴性。
反应试管5、第五种干扰菌液，含原有的鼠伤寒沙门氏菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管6、第六种干扰菌液，含原有的肠炎沙门氏菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管7、第七种干扰菌液，含原有的大肠杆菌0157浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管8、第八种干扰菌液，含原有的福氏志贺氏菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管9、第九种干扰菌液，含原有的单增李斯特菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管10、第十种干扰菌液，含原有的金黄色葡萄球菌浓度为18 CFU/mL，20次重复试险无白色浑浊为阴性；
反应试管11;第十一种灭菌去离子水对照液，不含任何菌，20次重复试险无白色浑浊为阴性。
[0039]结论:对含原有的亚利桑那菌浓度为18 CFU/mL,107 CFU/mLUO6 CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，能多次重复的检测到亚利桑那菌，这些检测亚利桑那菌的试验具有可重复性，具有可靠性。
[0040]对含原有的亚利桑那菌浓度为15CFU/mL的被检测液体样品，用本发明的引物进行LAMP法检测，检测亚利桑那菌的试验不具有完全可重复性，不具有可靠性。[0041 ]用本发明的引物进行LAMP法检测，对浓度为18 CFU/mL为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌0157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照液都分别是为阴性。说明本发明的引物能区分出鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌0157、福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和灭菌去离子水对照，可以推论本发明的引物能区分出沙门氏菌属的其它菌，能区分出肠杆菌科的其它细菌，能区分出革兰氏阳性杆菌的其它细菌，能区分出无任何菌的灭菌去离子水对照。
[0042]所以，说明使用本发明的引物进行LAMP法检测亚利桑那菌特异性高，可以作为检测亚利桑那菌的方法。
【主权项】
1.亚利桑那菌LAMP法检测用的引物，由4个单独引物组成，这4个单独引物是引物F3、弓丨物B3、引物FIP和引物BIP，这4个单独引物的序列如下:弓 I 物F3: AGCAGTTCCGCCGTCG； 引物B3: TACGGCAGCAGGGTCG ；引物 FIP: CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG ； 引物 BIP: GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。2.用权利要求1的亚利桑那菌LAMP法检测用的引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测的方法，包括以下步骤: 步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种0嫩:225!111缓冲蛋白胨水(8?￥，81^€6代(1 PeptoneWater)中添加亚利桑那菌标准菌种，培养18_24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水BPW培养液进行梯度稀释，使用GB 4789.2-2010方法对进行细菌计数，制得含有亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL的稀释液，然后将该稀释液取1.0ml，提取稀释液中的亚利桑那菌标准菌DNA;得到，含亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA; 步骤2、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒 选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为:Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂盒，该DNA扩增试剂盒组成为: (1)2X反应缓冲液(RM)， (2)BstDNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase), (3)去离子水(DW)， (4)引物溶液DNACPM DNA)， (5)阳性对照DNACPC DNA)； 步骤3、用本发明的引物进行LAMP法检测DNA (3.1)、配制LAMP法检测液:在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp朗报反应试管中加入下述各原料: 加入12.5yL的2 X反应缓冲液(RM)， 加入6.5yL去离子水(DW)， 加入0.5yL的引物F3， 加入0.5yL的引物B3， 加入0.5yL的引物FIP， 加入0.5yL的引物BIP， 加入1.0yL的Bst DNA聚合酶； 得到装有LAMP法检测液各原料的反应试管； 所述的引物为:弓 I 物F3: AGCAGTTCCGCCGTCG； 引物B3: TACGGCAGCAGGGTCG ；引物 FIP: CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG ；引物 BIP: GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT ； (3.2)、配制含有被检测物的反应试管: 向3.1步骤中的反应试管加入3.0yL步骤I获得的含亚利桑那菌浓度为16 CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA液体； (3.3)、对反应试管进行反应处理 对反应试管进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟HOOOrpm的条件进行瞬时离心处理，混合时注意不要产生气泡;然后放入63°C恒温水浴锅中水浴60min进行反应，再放入95 °C恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的Bst DNA聚合酶灭活每个反应试管中的反应物，以终止反应； (3.4 )、观察反应结果:反应试管有白色浑浊为阳性。
【专利摘要】本发明亚利桑那菌LAMP法检测用的引物和检测方法涉及用分子生物学方法，以LAMP法对亚利桑那菌DNA的检测。本发明引物进行LAMP法检测，对亚利桑那菌浓度为108？CFU/mL、107？CFU/mL、106？CFU/mL的被检测液体样品，多次重复为试险有白色浑浊为阳性；对选用的六种干扰菌浓度为108？CFU/mL的被检测液体样品和灭菌去离子水对照，多次重复为试险无白色浑浊为阴性。说明使用本发明的引物进行LAMP法检测亚利桑那菌特异性高，可以作为检测亚利桑那菌的方法。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN105586400
【申请号】CN201510911319
【发明人】谭志, 谢锂纱, 俞凌云, 车颖欣
【申请人】四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月11日