一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞培养技术领域，特别设及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物 及其成骨诱导方法。
【背景技术】
[0002] 骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清 仓ij、W及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。较小的骨缺损(通常指SmmW下），对于 一个健康的非吸烟者来说，有可能自行愈合;但骨缺损过大，或者是在较小的骨头上的骨缺 损，很难完全愈合。运就需要手术的干预，主要方法包括:骨移植、人工骨和组织工程骨。
[0003] 骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经 体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解 吸收的细胞支架或称细胞外基质上，运种生物材料支架可为细胞提供生存的=维空间，有 利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的=维支架上 生长，然后将运种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细 胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。因此足够量的成骨细胞在骨组织工程中成 为关键因素。如何通过诱导获得足够量的成骨种子细胞，并在诱导过程中维持种子细胞的 表型特征成为骨组织工程研究中的热点。
[0004] 脂肪组织是人体储存最大、容易获取和应用的组织，具有很大的临床应用前景。月旨 肪间充质干细胞(ADSCs)是一种成体干细胞，具有向血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞等 多向分化的潜能。目前，间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化是骨组织工程研究中的热点， 诱导的成骨细胞可应用于治疗骨头坏死、骨折后骨延迟愈合等骨科疾病。通常采用分离自 体脂肪间充质干细胞在体外扩增并向成骨诱导培养后植入体内。从抽取的脂肪组织中提取 的间充质干细胞作为介质在组织工程应用中取得明显成功。
[0005] 研究发现，巧粘附蛋白-IUca化erin-11)能够诱导间充质细胞向成骨细胞的分 化。巧粘附蛋白-11为巧粘附蛋白家族成员，参与多种生物学过程，如组织形成、胚胎发育、 骨组织形成等。成骨细胞持续表达Ca化erin-11，在骨和软骨中优先表达，控制着间充质细 胞向成骨细胞和软骨细胞的分化。但单纯采用巧粘附蛋白-11对间充质干细胞进行诱导时， 诱导分化率较弱。因此，对于能够提高脂肪间充质干细胞向成骨细胞诱导分化能力的技术 仍有需求。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方 法。该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化能 力。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[000引本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，包括巧粘附蛋白-11和富 血小板血浆(PRP)。
[0009]本发明发现将巧粘附蛋白-11和富血小板血浆按一定比例联合使用后，可显著提 高脂肪间充质干细胞向成骨细胞的转化效率，增强了成骨诱导分化能力。
[0010]作为优选，Wiig/mL计，巧粘附蛋白-11与富血小板血浆的比例为(0.1~1):(0.05 ~0.1)。
[0011]在本发明提供的一些实施例中，Wiig/mL计，觀枯附蛋白-11与富血小板血浆的比 例为 0.1:0.1。
[0012]在本发明提供的另一些实施例中，Wiig/mL计，觀枯附蛋白-11与富血小板血浆的 比例为0.5:0.08。
[001引在本发明提供的另一些实施例中，Wiig/mL计，觀枯附蛋白-11与富血小板血浆的 比例为1:0.05。
[0014] 作为优选，该脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物还包括基础培养基。
[0015] 作为优选，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量为：
[0016] 巧粘附蛋白-11: 0.1~化g/mL
[0017] 富血小板血浆；0.05~O.lmL/mL
[001引基础培养基： 补足。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用量 为：
[0020] 觀枯附蛋白-11: 0.化g/mL
[0021] 富血小板血浆：0.1 mL/ni;
[0022] 基础培养基： 补足。
[0023] 在本发明提供的另一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用 量为：
[0024] 觀枯附蛋白-11: 0.5iig/mL
[0025] 富血小板血浆：0.08 mL/mL
[0026] 基础培养基： 补足。
[0027] 在本发明提供的另一些实施例中，脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物中各组分用 量为：
[002引觀枯附蛋白-11: Uig/mL
[0029] 富血小板血浆：0.05 mL/mL
[0030] 基础培养基： 补足。
[0031] 在本发明提供的一些实施例中，富血小板血浆的制备方法为:将静脉血离屯、，取上 层血浆和白膜层，离屯、，取下层1/4体积的血浆，得到富血小板血浆。
[0032] 本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法，采用本发明提供的脂肪间 充质干细胞成骨诱导组合物诱导培养脂肪间充质干细胞，获得成骨细胞。
[0033] 作为优选，脂肪间充质干细胞为P3~P5代脂肪间充质干细胞。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，脂肪间充质干细胞为P3代脂肪间充质干细胞。 [0035]作为优选，诱导培养的时间为14~20天。
[0036]在本发明提供的一些实施例中，诱导培养的时间为14天。
[0037] 本发明提供了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法。该组合 物包括巧粘附蛋白-11和富血小板血浆。本发明至少具有如下优势之一：
[0038] 1、本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物可显著提高脂肪间充质干细 胞的成骨诱导分化能力；
[0039] 2、本发明采用PRP代替动物血清，减少了其应用的风险和免疫原性，并且可应用于 临床。
【附图说明】
[0040] 图1示P3代脂肪干细胞的细胞形态图片;其中图1-1为放大40倍的图片，图1-2为放 大100倍的图片；
[0041] 图2示P3代脂肪干细胞的流式鉴定图片；其中图2-1、2-2、2-3为对照组流式鉴定结 果，2-1示空白对照，2-2示CD73、HLA-DR的表达情况，2-3示CD90、CD45的表达情况；图2-4、2- 5、2-6为样品组流式鉴定结果，2-4示空白对照，2-5示CD73、HLA-DR的表达情况，2-6示CD90、 CD45的表达情况；
[0042] 图3示各组脂肪干细胞成骨分化诱导情况，其中，3-1示脂肪干细胞诱导前茜素红 染色情况(40X)，3-2示对照组1脂肪干细胞采用普通培养基诱导后的茜素红染色情况(40 X )，3-3示对照组2脂肪干细胞采用商品化培养基诱导后的茜素红染色情况(40 X )，3-4示 实验组1脂肪干细胞采用Ca化erin-11诱导后的茜素红染色情况(40X)，3-5示实验组2脂肪 干细胞采用PRP诱导后的茜素红染色情况(40 X )，3-6示实验组3脂肪干细胞采用Ca^erin-11和PRP联合诱导后的茜素红染色情况(40 X )。
【具体实施方式】
[0043] 本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法，本领域 技术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0044] 本发明提供的脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及其成骨诱导方法中所用生物 材料均可由市场购得。
[0045] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0046] 实施例1
[0047] 1、脂肪干细胞原代分离
[0048] 待脂肪组织与肿胀液自然分层后吸弃下层液体，加入等体积的生理盐水清洗脂肪 组织2次，吸弃下方溶液;将脂肪组织分装至SOmL离屯、管中，每管20mL，每管中加入等体积的 0.5 % I型胶原酶(终浓度为0.25 % )，充分混匀，封口，转移至恒溫空气摇床中，37°C、200R消 化50min;消化完成后离屯、，15(K)巧m离屯、IOmin;弃去离屯、后的脂肪和脂肪油，每管加入40mL 生理盐水重悬细胞，ISOOrpm离屯、5min，弃去上清，用普通培养基(DMEM/F1化10%FBS)重悬 细胞，并接种至培养皿中，待细胞汇合度达到80-90