从大到小进行梯度洗脱（100 :10，100 : 30， 100:50，100:70，100:90)，采用等馈分收集法(400-600mU收集，使用旋转蒸发仪(60-70°C) 回收溶剂。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集7-8个馈分，相同极性洗脱下 来的馈分进行合并。梯度洗脱结束后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂 时，加入无水乙醇洗脱，使用旋转蒸发仪回收溶剂。臭常山根正下醇萃取物经大孔树脂粗分 离并对相同极性的馈分进行合并后，共得到5个馈分，然后继续进行二级硅胶柱层析细分 离。
[005引3、提取物的二级硅胶柱层析分离
[0059] (1)确定起始洗脱剂
[0060] 首先采用薄层层析确定起始洗脱剂，具体步骤为:各取化L步骤2获得的5个馈分， 分别用丙酬稀释至200-3(K)yL，用毛细管点样于GF254薄层色谱板上，在层析缸中加入l-2mL 按一定比例配比（100:2~0:100)极性递增的石油酸：乙酸乙醋洗脱剂。将点好样品的薄层 板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.3~0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄 层板上沿0.5~1.0cm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，并将 薄层板放入舰缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在0.2~0.3时，即可确定此展开剂为起始洗 脱剂。最后确定各个馈分的起始洗脱剂的石油酸:乙酸乙醋配比范围是100:20-100:100。 [0061 ] (2)装柱:采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35 X 400mm，30 X 400mm，40 X 400mm。将 玻璃色谱柱垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止娃 胶泄漏。将200~300目硅胶放入烧杯中，加入适当量的起始洗脱剂，经充分揽拌，将硅胶内 的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅胶加完后，仍使起始洗脱剂流一段时间， 然后使色谱柱中高于硅胶面上的起始洗脱剂几乎全部流入接收瓶内。然后用橡皮塞在色谱 柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使其静置过夜，W压实硅胶，提高分离效 果。
[0062] (3)加样:样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面 上的多余洗脱剂放出。用丙酬溶解样品，加入适当量的200-300目硅胶拌匀，用吹风机吹干 溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量起 始洗脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块 脱脂棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分 离。
[0063] (4)洗脱:二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馈分收集法(150mL)收集，使用旋 转蒸发仪回收溶剂，经薄层层析(TLC)检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗 脱后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个 收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。
[0064] 4、NMR 和 MS 分析
[0065] 将样品用気代甲醇(MeOD)溶解，加入核磁管，由北京师范大学分析测试中屯、核磁 共振实验室应用化uker DRX500核磁共振波谱仪测定1h-匪R，i3C-醒R，丽BC-匪R和HSQC- NMR。由北京师范大学分析测试中屯、质谱实验室测定HRMS。
[0066] 实验结果：
[0067] 分析鉴定出的新结构化合物是一种生物碱，为无色结晶，舰化祕钟反应显阳性，分 子式为Ci8Hi7N〇3,分子量为296. 12,其结构如图1所示，其化学命名是（2)-3-(4- hydroxybenzylidene)-4-(4-hydroxyphenyl)-1-methylpyrrolidin-2-〇ne〇
[006引 1h 醒R(500MHz，Me0D)S7.39(lH，s，H-6)，7.23(2H，d，J = 8.2Hz，H-8，12)，7.05 (2H,d J = 8.0Hz,H-14,18),6.72(2H,d J = 8.0Hz,H-15,17),6.66(2H,d J = 8.1Hz,H-9, 11),4.48(lH，d，J = 7.8Hz，H-4) ,3.98(lH，d，J = 9.3Hz，H-5a)，3.27(lH，d，J = 9.9Hz，H-5 e)，2.98(3H，s，H-19).
[0069] 1化醒R(125MHz，Me0D)Sl70.8(C-2),158.2(C-10),156.1(C-16),133.5(C-13), 132.2(C-6),131.8(C-8,12),127.7(C-14,18),125.9(C-7),115.3(C-15,17),114.9(C-9, 11),57.0(C-5),40.3(C-4),29.0(C-19).
[0070] HMBC:H-4/C-14，C-18;H-6/C-8，C-12;H-8/C-6，C-10;H-9/C-7，C-10;H-1l/C-7，C- 10；H-12/C-6,C-10；H-14/C-4,C-16；H-15/C-13,C-16；H-17/C-13,C-16；H-18/C-4,C-16；H- 19/C-2,C-5.
[0071] HRMS m/z:294.1136
[0072] 实施例2、式(I)化合物及臭常山根的正下醇萃取物对线虫的毒力测定
[0073] 试验药物:实施例1中获得的式(I)化合物及臭常山根的正下醇萃取物。
[0074] 试虫:南方根结线虫二龄幼虫和松材线虫幼虫。
[00巧]试验方法：
[0076] W无水乙醇为溶剂配制浓度为20mg/250化的式（I)化合物母液备用。试验中用含 有1%无水乙醇的蒸馈水溶液作为稀释剂，配制浓度分别为800ppm、400ppm、200ppm、 lOOppm、50ppm的式（I)化合物溶液各4ml，每个浓度重复Ξ次。将试虫放置在24孔培养板内， 每孔放入40-60头均一大小的南方根结线虫。记录放入活虫数，每个重复加入ImL已配制好 的式（I)化合物溶液，加入溶液时从培养板边沿缓慢加入，W免对试虫造成不利影响。将培 养板置于溫度为25°C恒溫培养箱内，7化后检查活虫数，即得死亡虫数。判断方法为:卷曲或 者游动均为活。利用SPSS软件计算得到式（I)化合物的致死中浓度。W2%阿维菌素作为阳 性对照，浓度设定为 15ppm、5ppm、1.5ppm、0.5ppm。
[0077] 臭常山根的正下醇萃取物的毒力测定步骤与化合物相同，只是母液配制为20mg/ 25化1^，并稀释为160〇99111、80〇99111、40〇99111、20〇991]1运四个浓度进行测定。
[007引死亡率（％ ) = 100 X死虫数/试虫数
[00巧]校正死亡率（％ ) = 100 X处理组死亡率-对照组死亡率/1-对照组死亡率
[0080] 半致死剂量化化0)即引起50%试虫死亡率的剂量，使用Probit软件包计算得到半 致死剂量。
[0081] 实验结果：
[0082] 式(I)化合物及臭常山根的正下醇萃取物对南方根结线虫和松材线虫幼虫的毒性 测定结果如表1所示。
[0083] 表1.式(I)化合物及臭常山根的正下醇萃取物对线虫的毒性测定
[0084]
[0085] 实验数据表明，式（I)化合物具有较强的杀线虫活性，虽然式（I)化合物对南方根 结线虫和松材线虫的LDso与2%阿维菌素相比高出许多，但是该化合物是从臭常山的根部中 提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，可W作为天然农药长期使用而不会产 生环境污染的问题。
[0086] 从表1中还可W看出，臭常山根的正下醇萃取物也具有杀线虫活性，只是活性不及 式(I)化合物强。
【主权项】
1. 如式α)所示的化合物：2. 权利要求1所述的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。3. 权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。4. 权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。5. -种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要 求2所述的盐。6. 权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以臭常山根为原 料进行分离提纯获得式(I)所示的化合物或其盐。7. 根据权利要求6所述的制备方法，所述分离提纯包括采用乙醇浸提、正丁醇萃取、大 孔树脂分离和硅胶柱层析。8. 根据权利要求7所述的制备方法， 所述乙醇浸提:将干燥的臭常山根依次用95 %乙醇、75 %乙醇、50 %乙醇和蒸馏水分别 浸泡3天； 所述正丁醇萃取:所得乙醇浸提液在50°C蒸发浓缩后，室温下经过正丁醇萃取将水相 弃去，留正丁醇相在60-70°C水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正丁醇得正丁醇萃取 物； 所述大孔树脂分离:先用5%氢氧化钠浸泡大孔树脂4-6h，然后用蒸馏水洗至中性，再 用5%盐酸浸泡4-6h，然后用蒸馏水洗至中性;将预处理后的大孔树脂装入玻璃色谱柱，然 后将臭常山根的正丁醇萃取物用蒸馏水溶解后，加入玻璃色谱柱中；最后用蒸馏水-无水乙 醇按极性从大到小进行梯度洗脱，采用等馏分收集法收集得到粗分离物； 所述硅胶柱层析:用丙酮溶解粗分离物，加 30-50g硅胶搅拌均匀，用电吹风将拌过样品 的硅胶吹干后加入硅胶柱中，以石油醚:乙酸乙酯为洗脱剂进行等梯度洗脱，按等馏分收集 法收集活性成分。9. 臭常山根在防治线虫中的用途。10. -种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭常山根的正丁醇提取物。
【专利摘要】本发明涉及植物病害防治技术，具体涉及一种分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用途。所述化合物的结构如式(I)所示，是采用乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层析法从臭常山根部提取而得，其化学命名是(Z)?3?(4?hydroxybenzylidene)?4?(4?hydroxyphenyl)?1?methylpyrrolidin?2?one。将所述化合物分别对南方根结线虫和松材线虫进行室内毒力测定，结果表明该化合物具有较强的杀线虫活性。该化合物在自然条件下易分解，不会引起生物富集现象，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。
【IPC分类】A01N65/36, A01N43/36, C07D207/38, A01P5/00
【公开号】CN105712921
【申请号】CN201610044646
【发明人】刘志龙, 刘昕超, 刘奇志, 赖道万, 周立刚, 石旺鹏
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月22日