一种双光子荧光探针及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中双光子荧光探针是以咔唑作为母体，结构如下：本发明双光子荧光探针分子在三价金离子(Au3+)与其他干扰试剂共存的体系中，表现出专一性响应和高的灵敏度。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒副作用，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针对HeLa细胞渗透性好，适用于细胞线粒体内Au3+的双光子荧光成像和定性检测。
【专利说明】
一种双光子荧光探针及其制备方法和用途 一、
技术领域
[0001] 本发明涉及一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现双光子成像定性检 测细胞线粒体内的Au3+，具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点。 二、
【背景技术】
[0002] 近年来，由于金的生物适应性，功能性金纳米粒子多用作药物、基因传输、生物传 感器和生物成像的材料。尽管金很稳定且有很好的生物兼容性，而且以其离子形式(Au+和 Au3+)为基础合成的药物可用于治疗类风湿性关节炎、肺结核和癌症、哮喘以及疟疾等疾病， 但金元素的毒理作用还是应该受到重视。金的离子形式对人体有潜在的毒理作用，特别是 Au3+能引起生物体系严重中毒，因为它能结合DNA和神经系统，甚至能引起DNA链断裂。因此 制得能快速检测环境和生物样本中Au 3+的检测体系是一项重要的课题。
[0003] 线粒体是哺乳动物细胞中至关重要的一个细胞器，它在细胞凋亡的调控中（细胞 程序性死亡）和某些疾病如癌症细胞凋亡异常反应特征中起重要作用，使其成为颇具吸引 力的新抗癌药物的设计目标。由于线粒体高膜电位的驱动，亲脂性的金复合物会聚集在细 胞内的线粒体内，几类基于金的化合物(包括Au+和Au 3+的配合物)作为潜在的抗肿瘤剂引起 关注，并已证明涉及线粒体细胞凋亡通路。基于金物种线粒体靶向药物的广泛应用，发展高 效检测线粒体内金物种的方法很有必要，而且这对监测线粒体中金介导的生理过程和提高 药物在生物医学的发展非常重要。
[0004] 荧光化学探针由于具有灵敏度高、选择性好、易合成、廉价以及良好的生物应用等 特点，已成为生命科学和环境科学中主要的检测工具。目前，大部分检测细胞中Au 3+的荧光 探针均为单光子荧光探针，单光子荧光探针一般具有自荧光干扰大，激发波长小导致对细 胞的光毒性大，容易发生荧光自淬灭等缺点。与单光子荧光探针相比，双光子荧光探针具有 很多明显的优点，如:细胞光毒性小，不会引起荧光自淬灭，时间空间分辨率高，组织渗透深 度大。因而双光子荧光探针已经作为科学家们研究的一个重要课题。咔唑作为一种经典的 荧光团，不仅具有大的共辄体系和共平面性能，而且具有良好的光稳定性、低毒性。以咔唑 为荧光团的单光子荧光探针已经被很多文献所报道，但是作为双光子荧光探针的文献报道 相对较少。几乎没有关于专一检测细胞中线粒体内的Au 3+的双光子荧光探针的报道。 三、
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题 是通过分子设计得到一种合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞线粒体内 的Au 3+，具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点，细胞毒性测试表明本发明荧光探针 对细胞几乎没有毒性作用。
[0006] 本发明双光子荧光探针，简记为PyCM-3，以咔唑为母体，其结构式如下：
[0007]
[0008] 本发明双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 在圆底烧瓶内加入9-乙基-6-(4'-0--甲基碘化吡啶）乙烯）-3-甲酰基咔唑（1) (0.1171 g，0.25mmo 1)和无水甲醇12mL，于70 °C搅拌使其溶解，滴加3滴冰醋酸，再滴加 0.0413g(0.25mmol)2-肼基-苯并噻唑的无水甲醇溶液（8mL)，滴完后于70°C回流反应4h (TLC跟踪反应），反应结束后冷却至室温，静置，析出晶体，过滤，用无水甲醇洗涤3次，再用 无水甲醇重结晶得目标化合物PyCM-3，为棕红色片状固体，0.1188g，收率75%。
[0010] 本发明双光子荧光探针PyCM-3的合成过程如下：
[0011]
[0012]本发明双光子焚光探针在定性检测细胞中线粒体内的Au3+时作为检测试剂使用， 检测方法如下：
[0013] 将本发明双光子荧光探针溶于DMS0中制得ImM的母液，取100yL的该母液于10mL容 量瓶中，再用EtOH定容，配制成ΙΟμΜ的检测试剂。检测试剂分别在344nm和440nm有吸收峰； 加入8倍当量的Au 3+后，PyCM-3位于344nm的吸收峰消失，且在420nm出现一个新的吸收峰（图 2)。1(^11检测试剂加入8倍当量的各种金属离子、阴离子、活性氧物种和氨基酸后（图3a)，检 测445-750nm范围内的荧光光谱变化，可以看出PyCM-3仅对Au 3+有明显的荧光增强现象，具 有专一性响应;当随着Αιι3+(0-160μΜ)的不断加入，可以观察到540nm处的荧光发射峰强度逐 渐增强，在加入8倍当量的Au 3+后，荧光强度趋于饱和。斯托克斯位移约为120nm(图SbhlOyM 检测试剂在加入Au3+的浓度范围为0-5μΜ时，其荧光强度与Au3+的浓度之间有很好的线性关 系，检测浓度低至6 X 10-9Μ(图4)。
[0014]本发明双光子焚光探针结构简单，易于合成，利用Schiff base反应将作用位点和 荧光基团通过C = N键连接为一整体。本发明双光子荧光探针与Au3+有明确的作用位点，通过 荧光探针分子上的氮/硫配位原子先与Au 3+快速配位，然后诱导荧光探针分子上的C = N发生 水解生成化合物1(图1)。本发明双光子荧光探针以荧光强弱的变化来检测Au3+，与Au3+作用 后，在紫外灯下，肉眼就可以看出其荧光变化，荧光颜色和强度从无变成强的黄绿色光，操 作简单，快速灵敏。本发明双光子荧光探针对Au3+具有专一性荧光响应，灵敏度高，检测浓度 低。 四、
【附图说明】
[0015 ]图1是本发明荧光探针分子(Py CM-3)与Au3+反应机理图。
[0016] 图2是ΙΟμΜ探针加入8倍当量的Au3+前后的紫外吸收光谱图。
[0017] 图3是ΙΟμΜ探针加入8倍当量的各种金属离子、阴离子、活性氧物种和氨基酸前后 的荧光光谱图（3&)。1(^探针加入411 3+(0-16(^)的焚光滴定光谱图（313)，313插图是荧光最 大发射峰强度与Au3+浓度之间的散点图。
[0018] 图4是ΙΟμΜ探针在加入Αιι3+(0-5μΜ)后的荧光强度与浓度的线性关系图。
[0019] 图5是ΙΟμΜ探针加入8倍当量的Au3+后的双光子吸收截面数值(5a)和ΙΟμΜ探针加入 Au3+ (0-80μΜ)的双光子荧光滴定谱图（5b)。
[0020] 图6是在不同含量(5以1、1(^1、2(^1、3(^1〇的探针分子的作用下的他1^细胞存活率 图。
[0021] 图7是ΙΟμΜ探针分子在HeLa细胞中加入80μΜ Au3+前后的双光子荧光共聚焦成像照 片。PyCM-3( ΙΟμΜ)在HeLa细胞中培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗;然后向上述含荧 光探针的细胞培养液中加入80μΜ的Au 3+，继续培养30分钟后用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗。激发 波长为860nm，荧光发射收集范围为520-560nm。图a是细胞中只加 ΙΟμΜ探针PyCM-3的双光子 荧光共聚焦成像，图d是ΙΟμΜ探针分子在HeLa细胞中加入80μΜ Au3+的双光子荧光共聚焦成 像，图b、e是HeLa细胞的明场，图c是a、b的叠加，图f是d、e的叠加。
[0022]图8是ΙΟμΜ探针分子在HeLa细胞中加入80μΜ Au3+后的线粒体定位成像照片。其中 绿色通道^^〇1^1'1，激发波长为86〇111]1，发射波段为52〇-56〇111]1，这个通道用来接受探针分子 PyCM-3加入Au3+后发射的荧光。红色通道tracker2,激发波长为579nm，发射波长为579-619nm，这个通道用来接收商品化线粒体染色剂MitochondriaOTracker Red FM发射的焚 光。图a，b分别为红色通道和绿色通道下的荧光共聚焦成像。图d是HeLa细胞的明场，图c是 a、b、d的叠加，图e是图c中单个细胞的荧光强度剖面图，图f是PyCM-3和Mitochondria^ Tracker Red FM强度的相关性分布图，重叠系数为0.84。 五、
【具体实施方式】
[0023]下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0024] 实施例1:荧光探针分子PyCM-3的合成
[0025] 在圆底烧瓶内加入9-乙基-6_(4'-0--甲基碘化吡啶）乙烯）-3_甲酰基咔唑（1) (0.1171 g，0.25mmo 1)和无水甲醇12mL，于70 °C搅拌使其溶解，滴加3滴冰醋酸，再滴加 0.0413g(0.25mmol)2-肼基-苯并噻唑的无水甲醇溶液（8mL)，滴完后于70°C回流反应4h (TLC跟踪反应），反应结束后冷却至室温，静置，析出晶体，过滤，用无水甲醇洗涤3次，再用 无水甲醇重结晶得目标化合物PyCM-3，为棕红色片状固体，0.1188g，收率75%。
[0026] 4^^(40010^,01^0-(16)^12.14(8,110,8.82((1,1 = 6.4^,211),8.66(8,111), 8.49(s,lH) ,8.33(s,lH) ,8.22(t ,J=11,7Hz,3H) ,7.91(t,J = 9.7Hz,2H) ,7.77(t,J = 8.2Hz,3H) ,7.57(d,J= 16.2Hz, 1H) ,7.44(d,J = 7.8Hz,lH) ,7.31 (t,J = 7.2Hz, 1H) ,7.12 (t，J = 7.3Hz，lH)，4.52((1, J = 6.6Hz，2H)，4.24(s，3H)，1.37(t，J = 7.1Hz，3H) .13C 匪R (101MHz,DMS0-d6) :5176.05,153.38,145.25,144.56,142.49,141.83,141.73,139.64, 128.53,127.30,127.15,126.42,126.29,125.74,123.35,123.25,122.85,121.81,121.29, 120.85,110.75,110.52,47.19,37.99,14.36.
[0027] 实施例2:荧光探针分子的光谱测试
[0028] 将本发明荧光探针分子溶于DMS0中制得ImM的母液，取100yL的该母液于10mL容量 瓶中，再用EtOH定容，配制成ΙΟμΜ的检测试剂。检测试剂分别在344nm和440nm有吸收峰；加 入8倍当量的Au 3+后，PyCM-3位于344nm的吸收峰消失，420nm出现一个新的吸收峰（图2)。1(^ Μ检测试剂加入8倍当量的各种金属离子、阴离子、活性氧物种和氨基酸后（3a)，检测445-750nm范围内的荧光光谱变化，可以看出PyCM-3仅对Au 3+有明显的荧光增强现象，具有专一 性响应；当随着Α?!3+(0-160μΜ)的不断加入，可以观察到540nm处的荧光发射峰强度逐渐增 强，在加入8倍当量的Au 3+后，焚光强度趋于饱和。斯托克斯位移约为120nm(图31^10μΜ探针 在加入Au3+的浓度范围为0-5μΜ时，其荧光强度与Au 3+的浓度之间有很好的线性关系，检测 浓度低至6X10_9M(图4)。
[0029] 实施例3:荧光探针分子的双光子测试
[0030] 利用双光子诱导荧光测量技术，测试荧光探针分子(PyCM-3)与Au3+作用后的双光 子吸收截面，从图5a可以看出，双光子激发波长在860nm时，荧光探针分子与Au 3+作用后的最 大吸收截面是1208GM。从图5b可以看出，随着Αιι3+(0-80μΜ)的不断加入，可以观察到580nm处 的双光子荧光发射峰强度逐渐增强。
[0031] 实施例4:细胞毒性测试
[0032] MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)实验是根据已报道的文章 操作进行细胞毒性测试。分别在同一批细胞中加入〇，1〇,20,30,4(^1的荧光探针分子，条件 是在37 °C、含5 % C02的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式:细胞存活率％ = 0D570(样品）/0D570(对照组）X100,可算得细胞存活率（图6)。从图6中我们可以看出，浓度 为10μΜ时，细胞存活率还有97 %左右，当探针浓度达到20μΜ时，细胞存活率仍然有约80%， 说明了本发明荧光探针分子对细胞无明显毒性作用，因此可以用来检测细胞中线粒体内的 Au3+〇
[0033]实施例5:双光子荧光共聚焦细胞成像测试
[0034] HeLa细胞由DEME (invi trogen)培养液培养，成像前一天，HeLa细胞放于平底表面 皿中，成像时HeLa细胞和10μΜ的荧光探针PyCM-3的DMS0溶液于37°C、含5%C02的细胞培养 箱中孵育〇. 5小时，用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后，用双光子荧光共聚焦成像， 520-560nm通道内无荧光，得图7a。向上述含荧光探针的细胞培养液中加入(80μΜ) Au3+，在37 °C、含5%C02的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后，再 进行双光子荧光共聚焦成像，520-560nm通道内荧光明显增强，得图7d。图b、e是HeLa细胞的 明场，图c是a、b的叠加，图f是d、e的叠加。从图7中可以看出，探针可用于细胞内Au 3+的双光 子焚光成像。
[0035]实施例6:细胞定位测试
[0036] HeLa细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，HeLa细胞放于激光共聚 焦皿中，成像时HeLa细胞和10μΜ的荧光探针PyCM-3的DMS0溶液于37°C、含5%C02的细胞培 养箱中孵育ο. 5小时，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，再往培养皿中加入0.5μΜ商品化线 粒体染色剂MitochondriaOTracker Red FM溶液继续孵育0.5小时，用中性的roS缓冲溶液 洗涤3次后，再往培养皿中加入80μΜ Au3+溶液继续孵育0.5小时，用中性的roS缓冲溶液洗涤 3次后，用双光子荧光共聚焦成像，设置绿色通道tracker 1，激发波长为860nm，发射波段为 520-560nm，这个通道用来接受探针分子PyCM-3加入Au3 +后发射的荧光。设置红色通道 tracker2,激发波长为579nm，发射波长为579-619nm，这个通道用来接收商品化线粒体染色 剂MitochondriaOTracker Red FM发射的焚光。其中图a，b分别为红色通道和绿色通道下的 荧光共聚焦成像。图d是HeLa细胞的明场，图c是a、b、d的叠加，图e是图c中单个细胞的荧光 强度剖面图，图f是PyCM-3和MitochondriaOTracker Red FM强度的相关性分布图，重叠系 数为0.84。从图8可以看出，PyCM-3绝大多数定位在线粒体内，可用于细胞线粒体内Au 3+的双 光子荧光成像和定性检测。
【主权项】
1. 一种双光子巧光探针，其特征在于其结构式为：2. -种权利要求1所述的双光子巧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 在圆底烧瓶内加入9-乙基-6-(4'-(r-甲基舰化化晚）乙締)-3-甲酯基巧挫0.25mmol 和无水甲醇，于70°C揽拌使其溶解，滴加3滴冰醋酸，再滴加0.25mmol 2-阱基-苯并嚷挫的 无水甲醇溶液，滴完后于70°C回流反应地，反应结束后冷却至室溫，静置，析出晶体，过滤， 用无水甲醇洗涂3次，再用无水甲醇重结晶得目标产物。3. -种权利要求1所述的双光子巧光探针的用途，其特征在于： 所述双光子巧光探针在定性检测细胞中线粒体内的Au3+时作为检测试剂使用。
【文档编号】C07D417/14GK105906619SQ201610334026
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】冯燕, 王文娟, 王奇, 孟祥明, 朱满洲
【申请人】安徽大学