一种具有趋骨性的去铁敏衍生化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明开发了一种具有趋骨性的去铁敏衍生物及其制备方法和应用。更具体来说，本发明提供了一种具有式(1)的结构的化合物及其药学上可接受的盐、酯、酰胺、酰卤、水合物或溶剂合物。本发明还提供了该式(1)的化合物的制备方法及其在制备用于治疗骨质疏松、骨坏死、骨折延迟性愈或不愈合和骨缺损的药物中的应用。
【专利说明】
一种具有趋骨性的去铁敏衍生化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种去铁敏衍生化合物，通过对该化合物进行结构改性，使得该化合 物同时具有优良的铁络合能力和骨亲和性。本发明还提供了该去铁敏衍生化合物的制备方 法及其在制备用于治疗骨质疏松、骨坏死、骨折延迟性愈合或不愈合和骨缺损的药物中的 应用。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症(〇ste〇p〇r〇Sis，0P)是以骨量进行性降低、骨微结构破坏、骨脆性增加 为主要病理特征的骨代谢性疾病，易发骨折是骨质疏松导致的最严重后果之一。骨质疏松 不仅是危害老年人尤其是绝经后妇女健康及影响其生活质量的医学问题，而且已成为当今 老龄社会的严重社会问题，为此，世界各国都倾注大量的人力、物力，以期在阐明其发生机 理的基础上，提出合理、强效的防治策略。
[0003] 骨质疏松的药物治疗，除应用钙制剂和促进钙吸收的基础干预外，还包括雌激素 类、选择性雌激素受体调节剂、降钙素类、二磷酸盐类、甲状旁腺素、锶盐等。目前，针对骨转 换过程中，成骨细胞性骨形成与破骨细胞性骨吸收功能间"耦联"因子，正在研制或正在进 行临床试验RANKL蛋白和骨硬化蛋白可溶性抗体等治疗骨质疏松的生物制剂。
[0004] 缺血性骨坏死尤其是缺血性股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head, 0NFH)，分创伤性与非创伤性两类，皆以骨进行性坏死、骨吸收为主要病理特征。在关节部位 (如0NFH)，因软骨下骨坏死、吸收，可造成关节软骨塌陷，致残率高。老年人骨质疏松性髋部 骨折，是创伤性ONFH的主要病因。迄今，有关缺血性骨坏死的发病机制不清，其有效的治疗 药物缺乏，目前尝试性应用低分子肝素、二膦酸盐、普伐他汀等药物治疗的有效性有待确定 或难以凑效。
[0005] 尽管骨质疏松与骨坏死间的关联性尚待阐明，但越来越多的研究表明，骨质疏松 的发生和发展与体内铁过载和骨组织供血不足(尤其在老年人)密切相关，并且已被认为是 骨质疏松症的发生和发展的独立因素;不明原因所致骨组织血供障碍是骨坏死发生发展的 始动因素，亦为现在共识的观点。因此，改善和恢复骨组织血供，不仅具有保护骨组织构筑、 防治骨质疏松和骨坏死的功效，而且因骨质疏松性骨折的减少，将使骨坏死的发病率减低。
[0006] 去铁敏，又名去铁胺(deferoxamine，DF0)，具有式(3)所示的结构，其可以1:1比例 与Fe 3+结合。
[0007]
[0008] DFO作为铁离子络合剂，于1970年代开始应用于临床，主要用于治疗血色素沉着病 和地中海贫血、镰状细胞贫血等由于输血引起的慢性铁负荷过重的疾病。近年来申请者的 研究发现，DFO络合铁离子的特性，可激活成骨细胞细胞低氧/低氧诱导因子(HIF)-a通路， 而刺激骨组织血管新生，进而促进骨形成和骨修复，DFO激活低氧/HIF-α通路可促进骨形成 的有益作用，正在引导药用低氧模拟化合物的研发及骨病损的防治，并呈热点研究内容的 发展趋势。因此，DFO可至少通过直接络合骨组织中过载铁离子和间接诱生骨组织血管的二 种途径，而发挥骨保护作用。虽然，DFO使用相对安全，但半衰期短，需缓慢皮下或静脉输注， 并因 DFO水溶性的特点和骨血流量、代谢相对低下的特征，使DFO在骨组织中的分布率较低； 加大DFO剂量和用药时间，可引起听力或视力障碍、生长发育迟缓、骨骼变形等不良反应，从 而限制了DFO的骨作用效果，目前还难以适用于进行性骨丢失疾病的系统性药物治疗。
[0009] 为了解决以上问题，本发明的发明人发现，通过对DFO进行特殊的结构改性，可以 使其呈现对骨组织具有亲和性的特点，同时不影响DFO络合铁离子的活性，由此得到具有趋 骨性的DFO衍生化合物，使用该化合物能够实现将DFO导入并浓集于骨组织中，以期特异性 地增加 DFO在骨组织中的浓度，提高其防治骨质疏松、骨坏死等骨代谢性疾病药效，减少药 物系统性不良作用。
【发明内容】
[0010] 本发明的第一个方面提供了一种式（1)所示的化合物，及其药学上可接受的盐、 酯、酰胺、酰卤、水合物或溶剂合物：
[0011]
[0012] 其中R1选自以下基团：取代或未取代的C1-C1O烷基、取代或未取代的C 1-C1O烯基、取 代或未取代的C1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C 1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘；
[0013] R2-R4各自独立地选自各自独立地以下基团：羟基、取代或未取代的C1-C 1Q烷基、取 代或未取代的C1-Ciq烯基、取代或未取代的C 1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、 氯、溴和碘；
[0014] R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 1Q烷基、取代或未取 代的C1-Ciq烯基、取代或未取代的C 1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和 碘；
[0015] R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 1Q烷基、取代或未 取代的C1-Ciq烯基、取代或未取代的C 1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴 和碘；
[0016] m是选自以下的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12;
[0017] A是源自包含1-8个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸的基团，通过其中的一个氮 原子与式(1)所示化合物的其它部分相连。
[0018] 根据本发明的一个实施方式，所述A基团是选自以下的基团，通过所示氮原子的单 键与式（1)所示化合物的其它部分相连：
[0019]
[0020] 在以上基团中，η是选自以下的整数：1、2、3、4、5和6。
[0021] 根据本发明的一个优选的实施方式，在式（1)所示的化合物中，R1选自以下基团： 取代或未取代的(^-〇 4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C1-C 4烷氧基、取代 或未取代的C1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘；
[0022] R2-R4各自独立地选自以下基团：羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取代 的&_〇4烯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C 4烯氧基、氟、氯、溴和碘； [0023] R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取 代的C1-C4烯基、取代或未取代的&-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C 4烯氧基、氟、氯、溴和碘； [0024] R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取 代的C1-C4烯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C 1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘。
[0025] 本发明的第二个方面提供了一种用来制备所述式（1)的化合物的方法，该方法包 括以下步骤：
[0026] (i)使得包含1-8个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸与醇反应，以对所述有机多 元酸所有的羧基进行保护；
[0027] (ii)使得步骤(i)制得的羧基收到保护的有机多元酸与C3-C14二酸的酸酐反应；
[0028] (i i i)使得步骤(i i)的产物与具有式(2)的去铁敏或去铁敏衍生物反应；
[0029] (iv)对步骤（iii)制得的产物的受到保护的羧基进行脱保护，得到式（1)的化合 物：
[0030]
[0031] 其中在式(2)所示的结构中，R1选自以下基团：取代或未取代的心^^)烷基、取代或 未取代的&-&〇烯基、取代或未取代的C 1-C1Q烷氧基、取代或未取代的C1-C1Q烯氧基、氟、氯、 溴和碘;优选取代或未取代的C 1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C 1-C4 烷氧基、取代或未取代的C1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘；
[0032] R2-R4各自独立地选自以下基团：羟基、取代或未取代的C 1-Ciq烷基、取代或未取代 的&-&〇烯基、取代或未取代的C1-C 1Q烷氧基、取代或未取代的C1-C1Q烯氧基、氟、氯、溴和碘； 优选羟基、取代或未取代的C 1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C 1-C4烷 氧基、取代或未取代的C1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘；
[0033] R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C 1-Ciq烷基、取代或未取 代的C1-C1Q烯基、取代或未取代的C1-C1Q烷氧基、取代或未取代的C 1-C1Q烯氧基、氟、氯、溴和 碘;优选氢、羟基、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C 4烯基、取代或未取代的 &-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘；
[0034] R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C 1-Ciq烷基、取代或未 取代的C1-C1Q烯基、取代或未取代的C 1-C1Q烷氧基、取代或未取代的C1-C1Q烯氧基、氟、氯、溴 和碘;氢、羟基、取代或未取代的C 1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C 1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘。
[0037] 根据本发明的一个实施方式，所述步骤(i)的反应在溶剂中，在存在催化剂的情况 下进行，
[0035] 根据本发明的一个实施方式，在用来制备式（1)的化合物的方法中，所述包含1 -8 个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸选自以下结构式中的一种或多种所示的含氮有机多元 酸： 1
[0038] 所述醇选自：C1-Ciq烷基醇和C7-C16#基醇;优选是苯甲醇；
[0039] 所述溶剂选自：苯、甲苯、环己烷、丙酮、乙醚、二甲醚、二丙醚、以及它们当中任意 两种或更多种的混合物；
[0040] 所述催化剂是选自以下的酸催化剂:硫酸、盐酸、磷酸、硝酸J1-C6烷基磺酸、苯磺 酸、甲苯磺酸;优选是对甲苯磺酸。
[0041] 根据本发明的另一个实施方式，所述步骤（ii)在选自以下的溶剂中进行:包含一 个或多个卤原子的液态烷烃，所述卤原子选自氟、氯、溴、碘;优选地，步骤(ii)使用的溶剂 选自一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、及其任意混合物。
[0042] 根据本发明的另一个实施方式，所述步骤(iii)在溶剂中、在使用催化剂的条件下 进行进行，
[0043] 所述溶剂选自：苯、甲苯、环己烷、丙酮、乙醚、二甲醚、二丙醚、N，N_二甲基甲酰胺 以及它们当中任意两种或更多种的混合物；
[0044]所述催化剂选自：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、IH-苯并 三唑-1-基氧代三(二甲氨基)磷鑰六氟磷酸盐(BOP)U-羟基苯并三氮唑(HOBT)和N，N'_二 环己基碳二亚胺(DCC)，优选六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
[0045] 根据本发明的另一个实施方式，所述步骤(iv)的羧基脱保护反应是在催化剂存在 的情况下通过氢化反应进行的，
[0046] 所述催化剂选自负载型贵金属催化剂，优选是负载型钯、铂、铑催化剂，更优选是 钯碳。
[0047]根据本发明的一个优选实施方式，当以上所述式（1)和式(2)中的取代基R^R45是 取代的基团的时候，表示这些基团上的任意一个或多个氢原子被选自以下的一种或多种基 团取代:Cl-ClQ烷基、Cl-C4烷基、Cl -ClQ烯基、Cl-C4烯基、Cl-ClQ烷氧基、Cl-C4烷氧基、氛基、氣、 氯、溴、碘、羟基、酯基、醚基、酰胺基、亚酰胺基。
[0048] 本发明的第三个方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：
[0049] 以上所述式（1)的化合物及其药学上可接受的盐、酯、酰胺、酰卤、水合物或溶剂合 物；
[0050] (ii)药学上可接受的任选的赋形剂、填料、载体和稀释剂中的一种或多种；以及
[0051] (iii)任选的不同于组分（i)的药学活性组分，所述药学活性组分选自：阿仑膦酸 钠片、唑仑膦酸钠、帕米膦酸二钠、维生素 D、利塞膦酸钠、特立帕肽、雷尼酸锶、雷洛昔芬、降 钙素、雌激素、尼尔雌醇、雌孕激、他莫昔芬、依普黄酮、氯屈膦酸二钠片、骨松宝颗粒、倍美 力、紫竹爱维、固苏桉、依替膦酸二钠片、邦特林、特乐定、葡萄糖酸钙片、葡萄糖酸钙锌口服 溶液、倍美盈、利巴韦林片、益钙宁、易维特、贝邦、密盖息、肾骨片、牡蛎碳酸钙、妈尔奇碳酸 钙D3片、维D2果糖酸钙注射液、盖瑞宁、氯屈膦酸二钠胶囊、阿法迪三、注射用骨肽、鹿瓜多 肽注射剂、丹红注射液、红花注射液、头孢拉定、克林霉素、万古霉素、低分子右旋糖酐氨基 酸、羟乙基淀粉注射液、低分子肝素钠注射液、乳酸钠林格注射液、甘油果糖氯化钠注射液。
[0052] 本发明的第四个方面提供了所示式（1)的化合物及其药学上可接受的盐、酯、酰 胺、酰卤、水合物或溶剂合物在制备用于治疗骨质疏松、骨坏死、骨折延迟性愈合或不愈合 和骨缺损的药物中的应用。
【附图说明】
[0053] 在本发明中结合附图对本发明的原理和实施方式进行描述。
[0054] 图1是根据本发明一个实施方式的合成式(1)的化合物的方法的流程图；
[0055] 图2是根据本发明一个实施方式化合物对三价铁离子络合能力的表征结果；
[0056]图3显示了根据本发明一个实施方式的化合物刺激成骨细胞表达HIF-Ia蛋白的表 征结果；
[0057]图4显示了根据本发明一个实施方式的化合物刺激成骨细胞表达VEGF、H〇-lmRNA 的表征结果(实时-PCR);
[0058]图5显示了根据本发明一个实施方式的化合物亲骨性能的表征结果。
【具体实施方式】
[0059] 在以下内容中将会对本发明进行进一步的详细描述。但是需要指出的是，以下的
【具体实施方式】仅仅以示例性的方式给出本发明的具体操作实例，但是本发明的保护范围不 仅限于此。本发明的保护范围仅仅由权利要求书所限定。本领域技术人员能够显而易见地 想到，可以在本发明权利要求书限定的保护范围之内对本发明所述的实施方式进行各种其 它的改良和替换，并且仍然能够实现相同的技术效果，达到本发明的最终技术目的。
[0060] 在本发明中，除非有相反的说明，所有的比例均为重量比，所有的百分数均为重量 百分数，温度的单位为°(：，压力的单位为帕。室温指实验室内常规的环境温度，随季节和位 置变化，通常为25°C。另外，本发明描述的所有数值范围均包括端值并且可以包括将公开的 范围的上限和下限互相任意组合得到的新的数值范围。例如，如果公开了某种组分的重量 百分含量为10~30重量％，优选15~25重量％，更优选20~23重量％，则相当于同时公开了 以下的数值范围：10~15重量％、10~25重量％、10~20重量％、10~23重量％、15~30重 量％、15~20重量％、15~23重量％、20~25重量％、23~25重量％。
[0061] 本发明的式（1)的化合物是通过对式(3)所示的去铁敏(DFO)或式(2)所示的去铁 敏衍生化合物进行进一步结构改性而制得的。可以看到，式(3)所示的去铁敏结构实际上包 括在式(2)所示结构的范围之内。在本发明的合成步骤中使用的式(2)所示的去铁敏衍生化 合物以及式(3)所示的去铁敏均属于本领域公知的商业产品，均可购自Sigma、国药集团和 阿拉丁公司。在本发明的实验中具体使用的去铁敏、去铁敏衍生化合物a、去铁敏衍生化合 物b、去铁敏衍生化合物c均购自Sigma公司。另外，本领域技术人员也可以根据所需的最终 产物的结构，在去铁敏的分子上进行任意的取代和修饰。
[0062] 为了制备本发明式（1)所示的化合物，发明人使用包含3-14个碳、优选3-8个碳、更 优选3-6个碳的二酰基连接基团将改性基团A与去铁敏中的端部氮原子共价连接。根据本发 明的一个实施方式，所述基团A是由包含至少一个氮原子和至少两个羧基的有机多元羧酸 脱去其氮原子上的一个氢原子而得到的。通过此种结构改性，使得式（1)的化合物总体上表 现出极佳的骨亲和性，同时铁络合能力基本上不受影响。
[0063]图1显示了以式(3)所示的去铁敏、丁二酸酐和亚氨基二乙酸为例描述了本发明的 趋骨性化合物(DFO-SF)的合成历程。但是需要指出的是，本发明的保护范围并不仅限于此， 可以根据目标产物的具体结构对所用原料的种类、反应条件和操作步骤进行调整。
[0064] 如图1所示，使用的亚氨基二乙酸的结构如下所示：
[0065]
[0066] 在图1所示的第一个步骤中，使用苯甲醇作为保护剂，在对甲苯磺酸的催化作用下 发生反应，使得亚氨基二乙酸的两个羧基均与苯甲醇发生酯化反应而被保护。
[0067] 在图1所示的第二个步骤中，使得第一个步骤的产物与丁二酸酸酐在氯仿溶剂中 反应，从而生成酰胺结构。
[0068]在图1所示的第三个步骤中，使得第二个步骤的产物去铁敏(DFO)在溶剂N，N-二甲 基甲酰胺中，在存在PyBOP催化剂的条件下进行反应，从而将酯化的亚氨基二乙酸通过丁二 酰基与去铁敏端部的氮原子相连。
[0069] 在图1所示的第四个步骤中，使用钯碳催化剂对第三个步骤的产物进行脱苄(脱保 护反应），制得最终的目标化合物。
[0070] 本发明的化合物可以用于药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本发明化 合物和药用赋形剂。
[0071] 所述的"治疗有效量"指本发明化合物的含量就其下限而言应足以提供所需的骨 病治疗效果，同时，就其上限而言尚不至于引起严重的不良副作用，即在本领域广泛认可的 效险比范围之内。该有效量取决于多种因素，例如但不限于:所治疗的适应症，严重程度，同 期治疗，疗程以及患者年龄，健康状况，医疗史等公众因素。基于所选的骨病药物即上述因 素，本领域技术人员不难确定或通过常规试验取定所述有效量。
[0072] 本发明药物组合物的剂型至少可以是固体剂，如片剂;或液体剂，如注射剂，主要 是全身即系统性用药。例如，可以口服、注射，包括肌肉注射和静脉注射给药等。
[0073] 所述的药用赋形剂为本领域所熟知。根据活性成分，剂型，所需的制剂特性，在不 影响本发明化合物疗效的前提下，本领域技术人员不难直接或通过常规试验做出合适的选 择。所述赋形剂例如但不限于:稀释剂，填充剂，崩解剂，粘合剂，增稠剂，矫味剂，抗微生物 剂，抗氧化剂，润滑剂等。
[0074] 本发明还提供了本发明化合物在制备治疗骨质疏松、骨坏死及其相关疾病的药物 中的用途。
[0075] 下面将结合实施例具体描述本发明的技术方案。
[0076] 实施例
[0077] 以下合成实施例1-4所使用的去铁敏、去铁敏衍生化合物a、去铁敏衍生化合物b、 去铁敏衍生化合物c均购自Sigma公司；亚氨基二乙酸和2，2 肼-1，2-二基二乙酸，2，2 亚 甲基-双脲二基二乙酸，2，2 丙基-1，3-双脲二基二乙酸均购自阿拉丁公司；丁二酸酐和己 二酸酐分别购自国药集团和阿拉丁公司；PyBOP购自Sigma公司；Pd/C购自Sigma公司，其Pd 掺杂量为10%;其余的化学试剂均为购自Sigma公司的分析级试剂;所使用的水为去离子双 蒸馏水。反应在常温常压条件下进行。化合物熔点用Fisher-John熔点仪测定。核磁共振谱 用Bruker AM-400型光谱仪测定。质谱用VG-707E质谱仪测定。元素分析用CarIo Erbal 106 型元素分析仪测定。
[0078]合成实施例1
[0079] 本实施例中合成得到了式(4)所示的DFO-SF化合物，即按照图1所示的反应历程所 示的最终化合物。
[0080]
[0081] 1.化合物(a)的制备
[0082] 向一个250ml的三颈烧瓶中加入60ml甲苯、95ml苯甲醇、6g亚氨基二乙酸和10.3g 甲苯-4-磺酸，反应混合物于80 °C下反应18h，溶液由乳白色浑浊变为澄清，令却后析出白色 固体，过滤后将白色固体溶于100mL三氯甲烷，在搅拌条件下向其中滴加三乙胺直至溶液澄 清，该溶液使用500mL饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，使用无水硫酸镁进行干燥，真空旋干 后得无色透明油状物13.6g，产率为96wt %。
[0083] 2.化合物(b)的制备
[0084] 取一个50ml圆底烧瓶，加入6.28g上述化合物(a)，再加入30ml三氯甲烷，搅拌得到 澄清溶液后向其中加入2.2g 丁二酸酐，于50°C下反应3h，真空旋干，得无色透明油状物 8.41g，过柱(硅胶柱色谱)后得7.19g产物，产率为86wt %。
[0085] 3.化合物（c)的制备
[0086] 取一个50ml圆底烧瓶，加入0.7g化合物(b)、5ml DMF和0.45g PyBOP，在冰浴条件 下搅拌lOmin，再加入3g NMM后继续搅拌。取一 15ml试管，称取0.5g去铁敏，加入5ml DMF，滴 加5M KOH水溶液至澄清后将该澄清溶液加入上述圆底烧瓶，常温下反应96h，白色固体析 出，滤出该白色沉淀，使用30mLDMF洗二次，使用30mLTHF洗一次，真空旋干得白色固体 〇.38 8，产率为58￥七％。
[0087] 4.化合物(d)的制备
[0088] 取一个25ml圆底烧瓶，加入0.38g上一步的反应产物（即化合物（C))，向其中加入 15ml DMF，0.04g Pd/C，将该圆底烧瓶置于氢化釜中，在压力为l.IMPa、温度为50°C的条件 下下反应3h，过滤后真空旋干DMF，加入20毫升乙醇，搅拌Ih后过滤，真空旋干得白色固体 〇. 31g，测得该产物的熔点为141.8-147.7°C，产率为99wt %。元素分析C33H57N7Oi4，理论值 (%):C 51·09，Η 7·41，Ν 12.64;实际值（％):C 51.05，H 7.44，N W.egc/H-NMlKd-DMSOM ppm:9.55(m，2H，ES:-CH2ra〇-)，6.69-7.71(m，3H，ES :-NH-)，3.95-4.15(m，4H，ES:-CH2-)， 3.44-3.47(m，6H，ES:-CH2-)，2.98-3.03(m，6H，ES :-CH2-)，2.5h2.59(m，4H，ES:-CH2-)，2.5 (m，2H，ES:-CH2-)，2.45-2.49(m，4H，ES :-CH2-)，1.97(m，2H，ES:-CH2-)，1.49-1.54(m，3H， ES:-OH)，1.47(m，3H，ES:-CH2〈），1.35-1.42(m，12H，ES :-CH2-)，1.2-1.26(m，6H，ES:-CH2-)。 MS(EI)m/z:776.4。
[0089] 合成实施例2
[0090] 在该实施例中完全重复以上实施例1的步骤，区别在于，使用以下结构式a所示的 去铁敏衍生物a，该去铁敏衍生物a的分子式为C26H50N609，分子量为590.71，使用的连接基 团是戊二酸酐，使用的亚二氨基二羧酸是2，2'_肼-I，2-二基二乙酸。所得产物的质谱表征 结果如下:MS(ESI )m/z : 836.2(理论值834.91)，其分子式为C35H62N8015，结果证明该产物 具有以下式(5)所示的结构：
[0091]
[0092]合成实施例3
[0093] 在该实施例中完全重复以上实施例1的步骤，区别在于，使用具有以下结构式b所 示结构的去铁敏衍生物b，其分子式为C27H52N609,分子量为604.74,使用的连接基团是己 二酸酐，使用的亚氨基二羧酸是2,2'_亚甲基-双脲二基二乙酸。所得产物的理论分子式为 C38H68N8015,质谱表征结果如下:MS(ESI)m/z :878.2(理论值876.99)，证明制得了具有式 (6)所示结构的产物。
[0094]
[0095]合成实施例4
[0096]在该实施例中完全重复以上实施例1的步骤，区别在于，使用具有以下结构式c所 示结构的去铁敏衍生物c，其分子式为C28H54N609,分子量为618.76,使用的连接基团是辛 二酸酐，使用的亚氨基二羧酸是2，2丙基-1，3-双脲二基二乙酸。所得产物的理论分子式 为〇43!178_015，质谱表征结果如下 :13"31)111/2:948.2(理论值947.12)，结果证明该实施 例制得的产物具有下式(7)所示的结构。
[0097:
[0098]实施例5铁离子络合性能测试
[0099] 在本实施例中表征了以上实施例中制得的化合物对三价铁离子的络合能力。具体 来说，将枸橡酸铁铵(ferric ammoniumcitrate，FAC)作为三价铁离子供体，溶解于双蒸水 形成溶液，分别向其中加入相同摩尔量的以上合成实施例1-4制备的化合物以及未进行本 发明所述取代改性的去铁敏，应用贝克曼DXC600全自动生化分析仪检测溶液中游离铁离子 含量，以了解本发明的化合物是否具有良好的络合铁离子的特性。图2显示了实施例1制备 的DFO-SF和未取代的DFO对铁离子的络合情况，图2中的对照是仅使用双蒸水而不添加 FAC 的情况下测得的铁离子含量。本发明实施例2-4制得的化合物也得到了与实施例1的化合物 基本相同的效果。
[0100] 该体外实验表明，在取代改性之后，本发明的化合物仍然可以实现令人满意的铁 离子络合性能。
[0101] 实施例6刺激细胞表达低氧诱导因子(HIF)-a及其下游靶基因的性能
[0102] 在该实施例中研究了本发明的化合物刺激细胞表达低氧诱导因子(HIF)-a及其下 游靶基因的性能。具体来说，取出生后48小时的小鼠颅盖骨，剪成1X1 Xlmm3小块、胰蛋白 酶和I型胶原酶消化，分离、纯化新生小鼠颅盖骨成骨细胞;以2X104/cm 2的细胞密度接种至 6孔培养板;细胞在培养板底贴壁生长至80%混合时，分别使用本发明实施例1-4的化合物 浓度为200yM(DF0净浓度）的条件培养液对以上所述的新生小鼠颅盖骨成骨细胞进行培养， 使用未取代改性的DFO浓度为200μΜ的条件培养液作为对照实验。培养液干预培养成骨细胞 48小时后，收获细胞，按照以下具体描述的步骤分别检测HIF-Ia蛋白表达状况和HIF-Ia及 其下游靶基因 mRNA表达状况，以了解DFO的性能是否因被SF修饰而改变。
[0103] I.HIF-Ia蛋白表达状况的检测(Westernblot法）
[0104] (1)提取细胞总蛋白细胞培养孔板中加入100μΙ蛋白裂解液RIPA(Bey〇time， China)和ΙμL蛋白酶抑制剂PMSF(Beyotime ,China)，放置于冰上；用细胞刮仔细刮取细胞， 将细胞转移至〇 . 5ml离心管中，冰上放置30分钟;4°C，12000g离心15分钟，将上清小心转移 至无菌离心管中，_80°C保存备用，此即为细胞总蛋白。（2)采用蛋白定量试剂盒(Beyotime China)测定蛋白浓度主要步骤为:取1.2ml蛋白标准配制液加入30mg BSA标准蛋白中，充分 溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液(配制后可立即使用，也可以-20°C长期保存）；取适 量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml;根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积 BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀;将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μ1加到96 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μ1;加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加 标准品稀释液到20μ1;各孔加入200μ1 BCA工作液，37 °C放置30分钟；测定Α562，540-595nm 之间的波长也可接受;根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。（3)蛋白电泳（电泳仪，Bio-Rad ， USA) 安装玻璃板 、灌胶 ，按顺序 ，每加样孔加入蛋 白量为 30yg; 未加样的上样孔 中加入 30μ1上样缓冲液平衡；120V电压条件下电泳约75-90min，溴酚蓝到达胶底部时停止电泳。 (4)切胶、转膜按预染的蛋白Marker (Thermo，USA)切取所需目的条带，将胶浸入事先准备好 的转膜缓冲液中；剪取PVDF膜(Mi 11 ipore，Germany )，并在右角上做标记，用甲醇浸润激活， 浸入转膜缓冲液中。安装转移装置"三明治结构"从下到上依次为滤纸-膜-胶-滤纸，每 层均需确保无气泡;将转膜盒(Bio-Rad，USA)用冰覆盖，200mA恒流转膜，转膜时间约2h左右 (分子量小的蛋白转膜时间可适当缩短）。（5)免疫反应将膜浸入5%脱脂奶粉中，置摇床于 室温摇动1小时；取出膜并另装入一适中的塑料袋，加入用2%BSA按1:500稀释的HIF-Ia抗 体(N 〇vus，USA)(-抗），封袋后，置于摇床，4°C条件下摇动过夜;弃一抗，洗膜3次;将膜另装 入一适中的塑料袋，加入用2%BSA按1:5000稀释的抗小鼠二抗(Abbkine，USA)，室温孵育1-2h;弃二抗，洗膜3次。（6)显影于Image Quant LAS 4000mini机器内显影，显影液 (Millipore Germany)为Millipore A、B液按1:1比例配制;保存条带图像。
[0105] 2. HIF-Ia及其下游靶基因 mRNA表达状况的检测
[0106] 按试剂盒（Sigma，USA)说明的"一步法"抽提细胞总RNA，主要步骤为：每毫升 Trizol液中加0.2ml氯仿，剧烈振动15秒，室温下静置3分钟；于4°C，12000g离心15分钟，取 上层无色液相，移入新的灭菌的无 RNA酶试管;按最初Trizol液的量，每毫升加入0.5ml异丙 醇沉淀RNA，置室温下10分钟;4°C，12000g离心10分钟，在试管底和侧壁可见白色胶样小滴； 按最初Trizol液的量，加入等量的75%乙醇洗涤;轻轻振荡，4°C，7500g离心5分钟；晾干RNA (切勿完全晾干，一般室温下晾5miη )，把RNA溶解于DEPC水中；56~60 °C，孵育IOmiη;分光光 度计检测RNA含量和浓度，RNA鉴定和初定量。应用PCR逆转录试剂盒(Takara，Japan )，RNA反 转录获cDNA，主要步骤为：取Iyg总RNA，随机引物ΙμL，补加 DEPC处理的双蒸水至12μ1，70°C 孵育5分钟；随后置于冰上，依次加入5x反应缓冲液4μ1，IOnM dNTP2yl，RNA酶抑制剂0.5μ1， 加 DEPC处理的双蒸水至19μ1，25Γ孵育5分钟后加入逆转录酶(M-MLV)lyl，使总体积为20μ 1;按照25 °C 10分钟，42 °C 60分钟，70 °C 10分钟PCR孵育器上孵育，完成后置于冰上终止反应； 逆转录的cDNA直接PCR或者-20°C保存。分别设计并合成低氧诱导因子(HIF)-Ia及其下游靶 基因一血管内皮生长因子(VEGF)和血红素加氧酶(HO)-I的基因序列引物(HIF-Ια引物序 列：上游-GGTATTATTCAGCACGAC，下游-GAGGGAAACATTACATC ; VEGF 引物序列：上游-AGTCCCATGAAGTGATCAAGTTCA，下游-ATCCGCATGATCTGCATGG ; HO-I 引物序列：上游-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA，下游-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA);按PCR荧光定量试剂盒 (Takara，Japan)说明，形成反应体系（SYBR :<Green，10yl;R0X Reference Dye ΙΙ，0·4μ1; 上下游引物，各〇 . 8μ1; cDNA，2 . ΟμL;双蒸水，补足至20μ1。）；定时定量PCR仪(AB Appl ied Biosystems，7500Real Time PCR System)定量检测并比较分析SF-DF0刺激细胞表达HIF-1 α及其下游靶基因（VEGF、H0-1)的状况（反应条件如下：94°C5分钟，94°C30s，55°C30s，72°C 30s，如此循环35次后，72°C 5分钟结束反应）。
[0107]本发明实施例1制得的DFO-SF与未取代改性的DFO测得的结果示于图3和图4。从图 3和图4的结果可以看到，与未取代改性的DFO相比，本发明实施例1制得的DFO-SF具有类似 的刺激成骨细胞表达HIF-Ια及其靶基因一血管内皮生长因子(VEGF)、氧合酶(HO)-I的性 能。本发明实施例2-4制备的化合物也表现出了与实施例1的化合物相同的效果。
[0108] 实施例7驱骨特性表征
[0109] 在该实施例中，使用同位素14C标记本发明实施例1-4的化合物中的DFO或DFO衍生 化合物结构之后，将该化合物配制成水溶液对小鼠进行腹腔注射或尾静脉注射，于不同时 相眼眶取血后处死，收集肾脏、股骨、脾脏、肺、肝脏和肌肉组织，采用液体闪烁计数仪 (WALLAC公司，Trilux 1450Micro Beta)测定各脏器中放射性强度，并将测得的cpm/mg组织 换算成dpm/mg组织。图5显示了本发明实施例1的DFO-SF化合物的表征结果，显示该化合物 在小鼠体内结构性能稳定，且通过本发明的取代改性能够驱动DFO在骨组织中浓集。本发明 实施例2-4制备的化合物也表现出了相与实施例1同的效果。
[0110] 综上所述，本发明实施例1-4合成得到的化合物对骨骼无不良影响，并且对骨代谢 有较高的活性，能促进骨基质的形成，可以用来将去铁敏(DFO)靶向导入并浓聚于骨组织 中，进而发挥络合铁离子、刺激骨组织血管新生的防治骨破坏的作用。本发明的趋骨性化合 物能特异性地增加药物在骨组织中的浓度，提高其改善骨质疏松成骨细胞和破骨细胞功 能、维持细胞特征性表型的有效作用。同时，由于改性基团与去铁敏结合后，对各自活性的 影响较小，对机体无毒副作用，所以可以提高骨病药物符合化合物的稳定性，并减少药物的 系统性不良作用。
【主权项】
1. 一种式（1)所示的化合物，及其药学上可接受的盐、酯、酰胺、酰卤、水合物或溶剂合 物-其中R1选自以下基团：取代或未取代的心^^)烷基、取代或未取代的C1-C1O烯基、取代或 未取代的&^^)烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘； R2-R4各自独立地选自各自独立地以下基团：羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或 未取代的&^^)烯基、取代或未取代的C1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C1-C iq烯氧基、氟、氯、 溴和碘； R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或未取代的 C1-Ciq烯基、取代或未取代的C1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C 1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘； R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或未取代 的&^^)烯基、取代或未取代的C1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C 1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘； m 是选自以下的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12; A是源自包含1-8个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸的基团，通过其中的一个氮原子 与式(1)所示化合物的其它部分相连。2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述A基团是选自以下的基团，通过所示氮 原子的单键与式（1)所示化合物的其它部分相连： 在以上基团中，η是选自以下的整数：1、2、3、4、5和6。3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于， Ri选自以下基团：取代或未取代的&-〇4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代 的&-〇4烷氧基、取代或未取代的C1-C4稀氧基、氟、氯、溴和碘； R2-R4各自独立地选自以下基团：羟基、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C 1-C4烯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C 4烯氧基、氟、氯、溴和碘； R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取代的 C1-C4烯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C 1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘； R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取代的 C1-C4烯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C 1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘。4. 一种用来制备如权利要求1-3中任一项所述的化合物的方法，该方法包括以下步骤： (i) 使得包含1-8个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸与醇反应，以对所述有机多元酸 所有的羧基进行保护； (ii) 使得步骤(i)制得的羧基受到保护的有机多元酸与C3-C14二酸的酸酐反应； (i i i)使得步骤(i i)的产物与具有式(2)的去铁敏或去铁敏衍生物反应； (iv)对步骤(iii)制得的产物的受到保护的羧基进行脱保护，得到式(1)的化合物：其中R1选自以下基团：取代或未取代的心^^)烷基、取代或未取代的C1-Ciq烯基、取代或 未取代的&^^)烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘;优选取代或未取代的 C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C 1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C4 烯氧基、氟、氯、溴和碘； R2-R4各自独立地选自以下基团：羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或未取代的C1-C10烯基、取代或未取代的C1-C iq烷氧基、取代或未取代的C1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘;优选 羟基、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C 1-C4烷氧基、 取代或未取代的&_〇4烯氧基、氟、氯、溴和碘； R5-R7各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或未取代的 C1-Ciq烯基、取代或未取代的C1-Ciq烷氧基、取代或未取代的C 1-Ciq烯氧基、氟、氯、溴和碘;优 选氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的&-C4烷 氧基、取代或未取代的C 1-C4烯氧基、氟、氯、溴和碘； R8-R45各自独立地选自以下基团：氢、羟基、取代或未取代的C1-C iq烷基、取代或未取代 的&-&〇烯基、取代或未取代的C1-C1Q烷氧基、取代或未取代的C 1-C1Q烯氧基、氟、氯、溴和碘； 氢、羟基、取代或未取代的C1-C 4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C1-C 4烧氧 基、取代或未取代的Cl_C4烯氧基、氟、氯、溴和碘。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)的反应在溶剂中，在存在催化剂 的情况下进行， 所述醇选自：C1-Ciq烷基醇和&-&6芳基醇;优选是苯甲醇； 所述溶剂选自：苯、甲苯、环己烷、丙酮、乙醚、二甲醚、二丙醚、以及它们当中任意两种 或更多种的混合物； 所述催化剂是选自以下的酸催化剂:硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、C1-C6烷基磺酸、苯磺酸、甲 苯磺酸;优选是对甲苯磺酸； 包含1-8个氮原子和2-6个羧基的有机多元酸选自以下化合物中的一种或多种：6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii)在选自以下的溶剂中进行:包 含一个或多个卤原子的液态烷烃，所述卤原子选自氟、氯、溴、碘;优选地，步骤(ii)使用的 溶剂选自一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、及其任意混合物。7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)在溶剂中、在使用催化剂的条 件下进行进行， 所述溶剂选自：苯、甲苯、环己烷、丙酮、乙醚、二甲醚、二丙醚、N，N-二甲基甲酰胺以及 它们当中任意两种或更多种的混合物； 所述催化剂选自：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、IH-苯并三唑-1-基氧代三(二甲氨基)磷鑰六氟磷酸盐(BOP)、1_羟基苯并三氮唑(HOBT)和N，N'_二环己基 碳二亚胺(DCC)，优选六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)的羧基脱保护反应是在催化剂 存在的情况下通过氢化反应进行的， 所述催化剂选自负载型贵金属催化剂，优选是负载型钯、铂、铑催化剂，更优选是钯碳。9. 一种药物组合物，该药物组合物包含： (i) 权利要求1-3中任一项所述的式（1)的化合物及其药学上可接受的盐、酯、酰胺、酰 卤、水合物或溶剂合物； (ii) 药学上可接受的任选的赋形剂、填料、载体和稀释剂中的一种或多种； (iii) 任选的不同于组分（i)的药学活性组分，所述药学活性组分选自：阿仑膦酸钠片、 唑仑膦酸钠、帕米膦酸二钠、维生素 D、利塞膦酸钠、特立帕肽、雷尼酸锶、雷洛昔芬、降钙素、 雌激素、尼尔雌醇、雌孕激、他莫昔芬、依普黄酮、氯屈膦酸二钠片、骨松宝颗粒、倍美力、紫 竹爱维、固苏桉、依替膦酸二钠片、邦特林、特乐定、葡萄糖酸钙片、葡萄糖酸钙锌口服溶液、 倍美盈、利巴韦林片、益钙宁、易维特、贝邦、密盖息、肾骨片、牡蛎碳酸钙、钙尔奇碳酸钙D3 片、维D2果糖酸钙注射液、盖瑞宁、氯屈膦酸二钠胶囊、阿法迪三、注射用骨肽、鹿瓜多肽注 射剂、丹红注射液、红花注射液、头孢拉定、克林霉素、万古霉素、低分子右旋糖酐氨基酸、羟 乙基淀粉注射液、低分子肝素钠注射液、乳酸钠林格注射液、甘油果糖氯化钠注射液。10.权利要求1-3中任一项所述的式（1)的化合物及其药学上可接受的盐、酯、酰胺、酰 卤、水合物或溶剂合物在制备用于治疗骨质疏松、骨坏死、骨折延迟性愈合或不愈合和骨缺 损的药物中的应用。
【文档编号】A61P19/10GK106008256SQ201610380476
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】邓廉夫, 陆俊, 齐进, 江敏
【申请人】上海市伤骨科研究所