一种tpmt基因多态性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于生物技术领域，涉及一种基因多态性检测试剂盒，具体涉及一种 TPMT基因多态性检测试剂盒.
【背景技术】
[0002] 嘌呤类药物是常用的肿瘤化疗药物之一，包括6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和巯唑嘌 呤。其药理学机制主要是在体内先经过酶的催化变成硫代嘌呤核苷酸后，阻止肌苷酸转变 为腺核苷酸及鸟核苷酸，干扰嘌呤代谢，竞争性抑制RNA和DNA的合成，进而抑制细胞增殖。 TPMT可使硫代嘌呤核苷酸发生甲基化，进而使其失去活性，从而使正常细胞免受过多活性 代谢物的损害。因此TPMT在嘌呤类药物的解毒过程中有着重要作用。TPMT酶活性降低或缺 乏与其等位基因多态性密切相关，表现为常染色体共显性遗传特征，TPMT基因 G238C、 G460A、A719G三个SNPs最为常见，且G238C、G460A、A719G三个SNPs发生突变后均会使TPM頂每 活性显著降低或几乎没有活性。因此，研发一种快速简单有效的检测TPMT基因 G238C、 G460A、A719G三个SNPs位点基因型的试剂盒显得尤为重要。 【实用新型内容】
[0003] 本实用新型提供一种采用荧光探针PCR技术，同时检测肿瘤化疗药物相关基因 TPMT的G238C、G460A、A719G三个SNPs位点多态性的试剂盒，要解决的技术问题为目前市场 上针对TPMT基因多态性检测成本高、耗时、特异性不强且操作复杂的问题，本实用新型能较 好的应用于TPMT基因 G238C、G460A、A719G三个位点单核苷酸多态性检测，体积小，操作简 单，便于运输携带和使用。
[0004] 本实用新型提供的一种TPMT基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒 包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装 有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有野生型阳性对照的试剂管3、装有突变型阳性对 照的试剂管4、装有杂合子阳性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6、装有G238C位点基 因多态性检测反应液的试剂管7、装有G460A位点基因多态性检测反应液的试剂管8、装有 A719G位点基因多态性检测反应液的试剂管9。
[0005] 进一步的，所述的容器孔较佳的为7个，容器孔在所述的海绵衬垫上分3排排列，上 述的装有野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照、阴性对照的试剂管3、4、5、6 均为1.5ml试剂管，装有G238C、G460A、A719G三个位点基因多态性检测反应液的试剂管7、8、 9均为2ml试剂管。
[0006] 上述的试剂管7、试剂管8、试剂管9中装有的基因多态性检测反应液主要成分包 含:包括Taq DNA聚合酶、dUTPs、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）、特异性引物和探针及MgCL2。
[0007] 上述的Taq DNA聚合酶为本领域常规Taq DNA聚合酶，生产厂商较佳的包括TAKARA 或Pr ome ga，所述的特异性引物和探针优选的生产厂商为LIFE或TAKARA，所述的dNTP s、 MgCL2、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)均为常规dUTPs、MgCL2、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）。
[0008] 所述的阳性对照包括野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照，所述的 野生型阳性对照为分别含有G238C、G460A、A719G三个位点的野生型纯合子基因序列及其多 态性检测上游和下游引物及引物之间的线粒体DNA序列的质粒，突变型阳性对照为分别含 有G238C、G460A、A719G三个位点的突变型纯合子基因及其多态性检测上游和下游引物及 弓丨物之间的线粒体DNA序列的质粒，杂合子阳性对照为等比例混合的野生型阳性对照质粒 和突变型阳性对照质粒。
[0009] 所述的G238C位点基因多态性检测引物包括：
[0010] 上游引物，其序列为：5，-!'(：1'11^^厶厶0(：〇^16厶厶〇^6厶厶1'-3，。
[0011]下游引物，其序列为：5 '-ITGTATCCCAAGITCACTGAITTCC-3 '。
[0012]所述的G460A位点基因多态性检测引物包括：
[0013] 上游引物，其序列为：5，-4161'1'1'1'11'(：1'(：1'1'1'0^^^^664(：-3，。
[0014] 下游引物，其序列为:5'-17〇^厶厶0厶了厶厶了厶厶(：〇^1'1'11^厶-3'。
[0015]所述的A719G位点基因多态性检测引物包括：
[0016] 上游引物，其序列为：5，-厶!^0^6厶丁611^1'1'(：1'11^丁厶6丁厶-3，。
[0017] 下游引物，其序列为：5，-0厶丁〇^11^〇厶1'1'1'11^66(：1'11^6-3，。
[0018]所述的G238C位点基因多态性检测探针包括：
[0019] 野生型检测探针，其序列为:5 '-TTATGCAGGTTTGCAGACCGGGGA-3 '，其5 '端标记物为 J0E，3'标记物为BHQ1。
[0020] 突变型检测探针，其序列为:5 '-TTATGCAGGTTTCCAGACCGGGGA-3 '，其5 '端标记物为 CY5,3'标记物为BHQ2。
[0021 ]所述的G460A位点基因多态性检测探针包括：
[0022] 野生型检测探针，其序列为：5 '-TGGGATAGAGGAGCAITAGTTGCCATT-3 '，其5 '端标记 物为R0X，3 '标记物为BHQ1。
[0023] 突变型检测探针，其序列为：5 '-TGGGATAGAGGAACAITAGTTGCCATT-3 '，其5 '端标记 物为TAMRA，3 '标记物为BHQ2。
[0024] 所述的A719G位点基因多态性检测探针包括：
[0025] 野生型检测探针，其序列为：5，-TGAAAAGTTATATCTACTTACAGAAAAGTAAAT-3，，其5， 端标记物为FAM，3 '标记物为MGB。
[0026] 突变型检测探针，其序列为：5 ' -TGAAAAGTTATGTCTACTTACAGAAAAGTAAAT-3 '，其5 ' 端标记物为VIC，3 '标记物为MGB。
[0027]本实用新型较佳的实施方法为：
[0028] 1.试剂准备:将试剂盒中3管检测反应液分别取35此与阳性对照、阴性对照及待检 样本的基因组DNA 15yL混匀待扩增。
[0029] 2.扩增检测:进行PCR扩增检测。
[0030] 3 ?检测结果分析。
[0031 ]优选地，所述的PCR扩增检测步骤包括：
[0032] 1.荧光通道选择:G238C位点基因多态性检测反应液对应选择J0E和CY5 2个检测 通道，G460A位点基因多态性检测反应液对应选择R0X和TAMRA 2个检测通道，A719G位点基 因多态性检测反应液对应选择FAM和VIC 2个检测通道，参比荧光设置为none。
[0033] 2.反应条件设定:反应体积设定为50yL，UNG酶反应条件为37 °C加热5分钟，预变性 条件为95°C加热5分钟，变性条件为95°C，15秒，以及退火、延伸及检测荧光条件为60°C，60 秒，共40个循环。
[0034] 应用本实用新型的有益效果为:本实用新型提供的TPMT基因 G238C、G460A、A719G 三个位点多态性扩增检测试剂盒，通过使用优化设计的特异性检测引物和探针及PCR扩增 反应条件，有效克服了传统检测方法步骤繁琐，耗时，假阳性和假阴性易出现的缺点，大大 提高TPMT基因 G238C、G460A、A719G三个位点多态性检测的特异性。
[0035] 本实用新型提供的适用于TPMT基因 G238C、G460A、A719G三个位点多态性扩增检测 的试剂盒设计合理，内部结构及各离心管排列有序，大小适宜，便于运输和使用。
【附图说明】
[0036]图1为本实用新型的TPMT基因多态性检测试剂盒结构示意图。
[0037]图2为本实用新型的G238C位点基因多态性检测反应液对野生型、突变型及杂合子 样本检测结果图，其中A标示野生型样本J0E通道检测曲线，B标示突变型样本CY5通道检测 曲线，C和D分别标示杂合子样本J0E和CY5通道检测曲线。
[0038]图3为本实用新型的G460A位点基因多态性检测反应液对野生型、突变型及杂合子 样本检测结果图，其中E标示野生型样本R0X通道检测曲线，F标示突变型样本TAMRA通道检 测曲线，G和H分别标示杂合子样本R0X和TAMRA通道检测曲线。
[0039] 图4为本实用新型的A719G位点基因多态性检测反应液对野生型、突变型及杂合子 样本检测结果图，其中I标示野生型样本FAM通道检测曲线，J标示突变型样本VIC通道检测 曲线，K和L分别标示杂合子样本FAM和VIC通道检测曲线。
【具体实施方式】
[0040] 为了能够更清楚地描述本实用新型的技术内容，下面通过【具体实施方式】并结合附 图进行进一步的详细说明。
[0041] 本实用新型所述的一种TPMT基因多态性检测试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2,所述 的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂 管，分别为装有野生型阳性对照的试剂管3、装有突变型阳性对照的试剂管4、装有杂合子阳 性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6、装有G238C位点基因多态性检测反应液的试剂 管7、装有G460A位点基因多态性检测反应液的试剂管8、装有A719G位点基因多态性检测反 应液的试剂管9。
[0042]所述的G2 38C、G460A、A719G三个位点基因多态性检测反应液的试剂管7、8、9中反 应液体积均为1.8ml，试剂管