一种聚木犀草素抗菌涂层的制备方法及抗菌效果测试方法
【专利摘要】一种基于木犀草素自聚合制备抗菌涂层的方法，属于生物材料领域。其特征是首先配置pH=8.5的Tris缓冲溶液，加入木犀草素的粉末，使木犀草素浓度为0.1mM，将氧化物类、金属、陶瓷类物体等待修饰基底浸泡于新鲜配制的木犀草素Tris溶液中，即可自发地在基底表面生成聚木犀草素抗菌涂层，静置时间为12h～24h且反应温度为35℃～40℃。将使用过的带有聚木犀草素抗菌涂层材料通过高温高压实验进行修复，带有聚木犀草素抗菌涂层在121℃，0.1Mpa环境下处理后即能重复使用。本发明制备的带有聚木犀草素抗菌涂层，对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用，而且绿色、环保、耐高温，预计有广泛的应用前景。
【专利说明】一种聚木犀草素抗菌涂层的制备方法及抗菌效果测试方法【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种聚木犀草素抗菌涂层的制备方法及抗菌效果测试方法，属于生物材料领域。
【技术背景】
[0002]近年来，与社会的快速发展相伴而生的环境污染、生态恶化及全球气候变暖已造成细菌变异、病毒泛滥和疾病蔓延等威胁人类健康的严重问题。因此，控制致病微生物传播，减少致病微生物污染，对于促进经济社会和谐发展具有十分重要的意义。同时，频发的流行病促使人们更加关注自身健康安全与生活工作环境的安全，所以，如何避免细菌的传播和感染，促进民用产品的消毒抗菌化、生活环境的清洁化己经成为目前需要解决的问题。研究和开发新型、高效、快速抗菌材料已成为抗菌材料领域的研究热点。
[0003]抗菌材料自身具有抑制或杀灭微生物细胞的能力。其中，又包括涂层型抗菌材料，即在一些物体表面覆盖这种具有抗菌特性的涂层，使其增加抗菌特性。
[0004]木犀草素，属于黄酮类化合物的一个亚类，是一个具有邻苯二酚结构的化合物，常见于蔬菜和水果之中，例如芹菜、西兰花、洋葱叶子、萝卜、青椒、苹果皮和菊花中。据报道从紫苏的种子中提取的酚类物质对于口腔链球菌和卟啉单胞菌有显著的抗菌效果，所以，木犀草素可以被期望制造抗菌材料。然而，迄今为止，很多调查都旨在研究低分子量的黄酮类的生物学特征，很少关注黄酮聚合物，特别是它的抗菌特性。
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【发明内容】
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[0005]本发明提供了一种简单的制备聚木犀草素抗菌薄膜的方法，该方法工艺稳定，制备所得的抗菌薄膜具有良好的抗菌特性，且抗菌性能持久。
`[0006]受贻贝蛋白的黏附特性的启发，本发明介绍了一种简单的、具有普遍生物相容性聚木犀草素抗菌薄膜的合成方法，它几乎涵盖了所有固体表面，包括氧化物类、金属、陶瓷类物体表面。聚木犀草素抗菌薄膜的合成方法非常简便:将待修饰基底浸泡于新鲜配制的木犀草素Tris溶液中一段时间，即可自发地在基底表面生成聚木犀草素抗菌薄膜。进一步研究表明，其他的儿茶酚胺类化学物也可以模仿这种黏附特性，而且带有邻苯二酚基团的这类聚合物，可以与表面形成很强的作用力。这种由自发聚合作用在诸多材料表面均能形成高聚物薄膜的方法，相对于传统的薄膜制备方法而言比较新颖和简便。
[0007]根据目前的研究，我们发现合成的聚木犀草素抗菌薄膜具有良好的抗菌特性，尤其是对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌杀灭效果显著。此外，该抗菌薄膜能够经受高温湿法灭菌处理，经过121°C高温处理之后依然能够表现出对金黄色葡萄球菌的杀灭效果。
[0008]一种基于木犀草素自聚合制备抗菌涂层的方法，其特征是首先配置pH=8.5的Tris (三羟甲基氨基甲烷)缓冲溶液，加入木犀草素的粉末，使木犀草素浓度为0.1mM,将氧化物类、金属、陶瓷类物体等待修饰基底浸泡于新鲜配制的木犀草素Tris溶液中，即可自发地在基底表面生成聚木犀草素抗菌涂层，静置时间为12h~24h且反应温度为35°C~40。。。
[0009]使用过的带有聚木犀草素抗菌涂层材料可以通过高温高压实验进行修复，涂层在121°C，0.1Mpa环境下处理后即可重复使用。反复试验可知此涂层杀菌效果持久，显著，并且可以反复利用。
[0010]如上所述一种聚木犀草素抗菌涂层的抗菌效果测试方法，采用ASTME2149-01标准方法，具体步骤为:
[0011]成膜阶段:金黄色葡萄球菌在LB液体培养基37°C下过夜培养之后，用无菌的生理盐水按梯度稀释后作为工作溶液；
[0012]作用阶段:将带有聚木犀草素涂层的玻璃片放入含有1.5mL工作溶液的离心管中并且置于37°C摇床中；以不含有聚木犀草素抗菌涂层的玻璃片的工作溶液作为对照；
[0013]培养阶段:实验组的样品和对照组分别在震荡10小时后，取出100 μ L涂平板，每组平行涂三个，转入37°C恒温生化培养箱抗菌培养24小时后，观察计数，其杀菌效果可以用杀灭细菌的百分比来体现。
[0014]本发明制备的带有聚木犀草素抗菌涂层，对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用，而且绿色、环保、耐高温，预计有广泛的应用前景。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0015]图1为扫描电子显微镜(SEM)下裸氧化铟锡导电玻璃(ITO)表面(图1A);和基底为ITO并覆盖有聚木犀草素的薄膜的表面(图1B)。
[0016]图2为聚木犀草素薄膜的X射线光电子能谱(XPS)图。
[0017]图3为虚线对照为裸的粗糙金的红`外谱图，上为聚木犀草素薄膜的红外图谱，下为木犀草素粉末的红外图谱。
[0018]图4为木犀草素粉末的拉曼图谱。
[0019]图5为粗糙金表面为基底的聚木犀草素薄膜的拉曼光谱图。
[0020]图6为ITO为基底的聚木犀草素薄膜的循环伏安图。
【【具体实施方式】】
[0021]I涂层制备:
[0022]首先配置25mM，pH=8.5的Tris缓冲溶液，加入木犀草素的粉末，使木犀草素浓度为0.1mM，把基底放入此新鲜配置的木犀草素的溶液中，置于37°C下，静置18小时。木犀草素溶液的颜色在18小时后从无色变成了浅黄色，这可以说明在这个过程中木犀草素是发生了自聚合反应。
[0023]经反复试验可知，新配置的木犀草素溶液分别在35°C，40°C条件下，静置12h，24h后可得到同样的结果。
[0024]2聚木犀草素抗菌薄膜特性分析:
[0025]接触角实验表明，聚木犀草素抗菌薄膜存在的情况下，不锈钢表面接触角由72.4°减小到50.2°，在玻璃表面由38.7°增加到52.7°，进一步证实聚木犀草素抗菌薄膜的形成。
[0026]3处理好的玻璃片的抗菌特性由标准的动态定量抗菌效果测试方法ASTME2149-01来评估。
[0027]阶段一(成膜阶段):金黄色葡萄球菌在LB液体培养基37°C下过夜培养之后，用无菌的生理盐水按梯度稀释后作为工作溶液。
[0028]阶段二 (作用阶段):三片(0.5*2cm)带有聚木犀草素涂层的玻璃片放入含有1.5mL工作溶液的离心管中并且置于37°C摇床中。以不含有聚木犀草素抗菌薄膜的玻璃片的工作溶液作为对照。
[0029]阶段三(培养阶段):实验组的样品和对照组分别在震荡10小时后，取出100μ L涂平板，每组平行涂三个，转入37°C恒温生化培养箱抗菌培养24小时后，观察计数。其杀菌效果可以用杀灭细菌的百分比来体现。观察涂平板菌落数可知，聚木犀草素抗菌薄膜的杀菌效果可以达到99%以上。
[0030]由图1SEM图可以看出聚木犀草素抗菌薄膜已覆盖在ITO的表面，并且其聚合物的粒径在IOnm左右；根据AFM图经计算得到膜表面的粗糙度比裸的HOPG略小，为0.85。
[0031]通过图2，以ITO为基底通过X射线光电子能谱(XPS)分析可以清楚的看到薄膜的组成原子碳和氧分别在轨道电子结合能为285eV和523eV左右时有光电子谱峰。
[0032]通过傅里叶变换红外光谱测试，木犀草素的单体显示在波长3380CHT1左右有一个比较宽的酚羟基和羟基的吸收峰，在波长1664CHT1左右有羰基震动的吸收峰，在波长在lOOOcm-1到1500cm-1左右有一个指纹区域(图3);而在粗糙金表面形成的聚木犀草素抗菌薄膜的红外光谱显示，在波长为3380CHT1左右的酚羟基吸收峰和1640CHT1的羰基震动的吸收峰还在,但是在lOOOcnT1到1500CHT1左右的指纹区域消失了。
[0033]图4:以木犀草素单体粉末为测试样，通过拉曼光谱分析可知在1600cm—1附近可以显现C=O和C2=C3的特征峰，尤其在1221CHT1，1260cm-1,1303cm-1处吸收显著。他们分别反映了 C5，H和4，0H、C3H和B环上的C3H。
[0034]图5:在粗糙金表面为基底的聚木犀草素抗菌薄膜的拉曼光谱显示ieOOcnT1左右的吸收峰略有减小，在1518CHT1左右的吸收峰变得增强，这恰恰和3’ OH和4’ OH有关。在500cm-1到SOOcnT1C环的震动的三个峰减弱了，很可能是由于聚木犀草素B环的羟基吸附在了基底的表面。
[0035]图6:用电化学的方法来测试聚木犀草素的氧化还原活性，可以从图6中看到，虚线代表的是在0.1M的pH=7的PBS缓冲液中，用裸ITO做工作电极的一个充放电电流曲线，实线图代表的是在以ITO为基底，再覆盖有聚木犀草素抗菌薄膜后再次在此溶液中做的循环伏安图，从氧化还原电流曲线可以进一步验证聚木犀草素抗菌薄膜的形成与存在，并且电位在0.34V有B环最强的氧化电流，在0.54V时有其A环上不可逆的氧化电流。在第二圈和第三圈氧化峰电流略有减小，在此之后还可以看到B环对应的还原电流。虽然聚木犀草素的化学基团组成没有很明确得知，但推测它应该是与木犀草素单体类似的邻苯二酚类结构。
【权利要求】
1.一种基于木犀草素自聚合制备抗菌涂层的方法，其特征是首先配置PH=8.5的Tris缓冲溶液，加入木犀草素的粉末，使木犀草素浓度为0.1mM，将氧化物类、金属、陶瓷类物体待修饰基底浸泡于新鲜配制的木犀草素Tris溶液中，即可自发地在基底表面生成聚木犀草素抗菌涂层，静置时间为12h~24h且反应温度为35°C~40°C。
2.根据权利要求1所述一种基于木犀草素自聚合制备抗菌涂层的方法，其特征是将使用过的带有聚木犀草素抗菌涂层材料通过高温高压实验进行修复，带有聚木犀草素抗菌涂层在121 °C，0.1Mpa环境下处理后即能重复使用。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于木犀草素自聚合制备的抗菌涂层的抗菌效果测试方法，其特征是采用ASTME2149-01标准方法，具体步骤为: 成膜阶段:金黄色葡萄球菌在LB液体培养基37°C下过夜培养之后，用无菌的生理盐水按梯度稀释后作为工作溶液； 作用阶段:将带有聚木犀草素涂层的玻璃片放入含有1.5mL工作溶液的离心管中并且置于37°C摇床中；以不含有聚木犀草素抗菌涂层的玻璃片的工作溶液作为对照； 培养阶段:实验组的样品和对照组分别在震荡10小时后，取出100 μ L涂平板，每组平行涂三个，转入37°C恒温生化培养箱抗菌培养24小时后，观察计数，其杀菌效果可以用杀灭细菌的百分比来体现。`
【文档编号】C09D5/14GK103819954SQ201310562127
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】苏磊, 程靖雅, 关淼, 张学记 申请人:北京科技大学