一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用。

背景技术：

在生物学研究中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要而且不可缺少的工作。在日常科研中，由于蛋白样品的微量性，蛋白定量的结果不仅需要非常精确，而且要求进行蛋白定量的方法具备非常高的灵敏度；除此之外，抗干扰能力、检测试剂稳定、操作简单也是进行蛋白定量分析方法所必须考虑的因素。

蛋白质定量分析的方法有许多种。从技术原理上分，可以分为两大类。科研上常以光度测定（photometric）进行蛋白质定量，通过染料与蛋白相互作用，由已知浓度的蛋白质标准品的吸光值或荧光强度，来测定未知浓度的蛋白质样本。基于吸光值的蛋白定量方法被称之为第一类蛋白定量方法，如BCA法、Bradford法、Lowry法，这类试剂的检测结果存在线性度不佳、灵敏度差、检测时间较长、样品需求量大、抗干扰能力差且测量范围窄等缺点，因此在科研上的应用备受限制；第二类是以荧光染料为核心开发的蛋白定量方法，如Thermo公司旗下Molecular Probes的NanoOrange以及CBQCA，与第一类试剂相比，这类试剂在灵敏度方面得到较大提高。其中，CBQCA试剂本身几乎是无荧光的，但当在氰化物的存在情况下，它与蛋白质的伯胺相互作用形成高荧光性的物质，通过Ex/Em=450/550 nm对其荧光进行检测来计算蛋白质浓度。另外一种NanoOrange试剂在水溶液中也是不会发荧光的，只有与蛋白相互作用后，在Ex/Em=470/570nm处检测到最强荧光，通过荧光计、荧光酶标仪等检测荧光，从而定量蛋白质含量。

CBQCA试剂存在明显弊端，在其与蛋白质反应过程中需要氰化物的帮助，才能形成可检测的荧光物质，并且这种试剂的操作繁琐，仅孵育步骤就需要至少1小时以上。NanoOrange试剂虽然克服了CBQCA的缺点，但是依然存在很多问题，如NanoOrange检测范围狭窄，仅为0.1-10 ug/mL，线性度不佳，整个测量范围内，线性相关系数R²达不到0.99以上（R²越接近1表示线性度越好，只有在小数点之后有两个9以上才被认为线性度好），尤其在指纹区（0-1.25 ug/mL）范围更是达不到蛋白定量要求（在这个测量范围内，线性相关系数R²的值仅在0.92左右，远低于一般认可的0.95），重复性不好、信号稳定时间仅为6小时。

技术实现要素：

本发明的目的是公开一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法；具备灵敏度高，线性关系好、抗干扰性强、稳定性好、操作简单等优点，解决了现有蛋白定量分析方法中常见的问题。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种用于蛋白质定量的荧光染料，具有如下化学结构式：

其中R₁、R₂独立的选自C1～C12的直链烷基；R₃为-OH（羟基）、 C1～C8的直链或者支链烷基、-OCH₃（甲氧基）；n 为3～12。

本发明进一步公开了所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）以取代苯胺化合物、溴化合物为原料，在碳酸盐存在下，制备得到中间体I；

（2）以中间体I为原料，在三氯氧磷存在下，制备得到中间体II；

（3）以4-甲基吡啶与环烷基磺酸为原料，制备得到中间体III；

（4）以中间体II与中间体III为原料，在甲醇中反应制备得到用于蛋白质定量的荧光染料；

所述取代苯胺化合物的化学结构式为：

所述溴化合物的化学式为：R₁R₂Br；

所述环烷基磺酸的化学结构式为：

；n为3～12。

具体的制备方法为：

（1）反应瓶中加入取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐以及溶剂，于80～100℃ 反应；反应结束后提纯得到中间体I；

（2）反应瓶中加入溶剂，在氮气保护下，冰水浴条件下滴加三氯氧磷，滴加完成20～40分钟后滴加含有中间体I的1,2-二氯乙烷溶液，调节温度至80～100℃，反应；反应结束后提纯得到中间体II；

（3）反应瓶中加入4-甲基吡啶、环烷基磺酸，于80～100℃搅拌反应；反应结束后提纯得到中间体III；

（4）反应瓶中加入中间体II、 中间体III、六氢哌啶、甲醇，于55～65℃；反应结束后提纯得到用于蛋白质定量的荧光染料。

上述技术方案中，步骤（1）至（4）都采用TLC跟踪反应至完全结束；TLC跟踪时采用二氯甲烷/甲醇为展开剂，具体为体积比为90∶10的二氯甲烷/甲醇。取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐的摩尔比为1∶2.5∶2.5；三氯氧磷、中间体I的摩尔比为4∶1；4-甲基吡啶、环烷基磺酸的摩尔比为1∶3.6；中间体II、中间体III、六氢哌啶的摩尔比为1.6∶1∶0.05。

上述技术方案中，提纯具体为：

（1）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入清水中，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，再用饱和食盐水洗涤；然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体I；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5；

（2）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入冰水中，然后用二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷层，再饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体II；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5；

（3）反应结束后加入乙酸乙酯回流后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后得到中间体III；

（4）反应结束后，反应液旋干后硅胶过柱纯化，收集旋干得到用于蛋白质定量的荧光染料；过柱纯化时淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95∶5。

上述技术方案中，步骤（1）中，碳酸盐为碳酸钾，溶剂为二甲基甲酰胺。

本发明用于蛋白质定量的荧光染料在蛋白质定量分析时，（1）灵敏度高，与现有BCA、Bradford或Lowry蛋白定量分析相比，本发明检测蛋白浓度范围为0.1-25 ug/mL，灵敏度更佳；（2）应用广泛，本发明用于蛋白质定量的荧光染料受测样本不论为纯化蛋白或抗体皆适用，还可应用于含有还原剂、核酸、氨基酸与咪唑的蛋白样品；（3）耐受性好，本发明用于蛋白质定量的荧光染料对盐类、缓冲液、去垢剂或其他化学物质都有良好的耐受性；（4）高度均一性好，本发明用于蛋白质定量的荧光染料受蛋白组成差异的影响小，从而具有更出色的蛋白间均一性。因此本发明还公开了上述用于蛋白质定量的荧光染料在蛋白质定量分析中的应用以及上述用于蛋白质定量的荧光染料在制备蛋白质定量分析试剂中的应用。

本发明还公开了一种蛋白质定量分析的方法，包括以下步骤：

（1）将染料用缓冲液稀释得到染料工作液；所述染料为上述用于蛋白质定量的荧光染料；

（2）将待检测蛋白质溶液与染料工作液混合后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；

（3）将测试样本加入酶标板；然后测试荧光强度；最后将荧光强度带入牛血清白蛋白溶液浓度与荧光强度关系曲线，得出待检测蛋白质浓度，完成蛋白质定量分析。

牛血清白蛋白标准浓度与荧光强度关系曲线的制备为，配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液，然后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；将不同浓度的待检测蛋白质溶液对应的样本分别加入酶标板中，分别测试荧光强度，从而得到荧光强度与牛血清白蛋白溶液浓度的关系曲线。

可以将已知浓度的蛋白质溶液加入染料工作液中配制待检测蛋白质标准浓度溶液或者直接将待检测蛋白质加入染料工作液中配制待检测蛋白质标准浓度溶液。

优选的，本发明配制至少10个梯度的牛血清白蛋白标准浓度溶液；同一浓度蛋白质溶液对应的样本至少测试三组荧光强度数据。从而可以得到准确的测试结果。利用本发明公开的用于蛋白质定量的荧光染料进行蛋白质定量分析的检测范围为0.1～25 ug/mL；在整个检测范围以内（0～25 ug/mL），线性相关系数R²的值都在0.99以上；取得了意想不到的技术效果。

进一步的，本发明公开了一种蛋白质定量分析试剂，包括上述用于蛋白质定量的荧光染料。

本发明公开了一种用于蛋白质定量的荧光染料，其分子结构稳定，制备方法简易可控，作为蛋白质定量分析应用时，具有很强的抗干扰能力；特别是与现有技术相比，本发明还具有如下优点：

（1）信号稳定，现有蛋白质定量测定荧光信号稳定仅有6小时，而本发明用于蛋白质定量的荧光染料则高达16小时；（2）优越的检测范围，现有检测范围狭窄，仅为0～10 ug/mL，本发明用于蛋白质定量的荧光染料检测蛋白浓度的范围增大了2.5倍，检测范围为0.1～25 ug/mL；（3）高线性度，首先在指纹区（0～1.25 ug/mL）范围内，现有技术的线性相关系数R²的值仅在0.92左右，远低于0.95（R²越接近1表示线性度越好，只有在小数点之后有两个9以上才被认为线性度好），其次在其整个检测范围内（0～10 ug/mL），线性相关系数R²达不到0.99以上，而本发明用于蛋白质定量的荧光染料在整个检测范围以内（0～25 ug/mL），线性相关系数R²的值都在0.99以上；取得了意想不到的技术效果。

附图说明

图1为实施例一产物的质谱图；

图2为实施例二产物的质谱图；

图3为浓度为0-25 ug/mL的范围内，BSA标准浓度与荧光强度的关系曲线图；

图4为浓度为0-1.25 ug/mL的范围内，BSA标准浓度与荧光强度的关系曲线图。

具体实施方式

实施例一

具体合成步骤如下：

100 mL 反应瓶中加入0.8 g 3-叔丁基苯胺，2 mL 溴代正辛烷，1.85 g 碳酸钾，8 mL二甲基甲酰胺，搅拌，加热至90℃反应，TLC跟踪，展开剂为:石油醚:乙酸乙酯=90：10。反应结束后冷却至室温，倒入200 mL清水中，乙酸乙酯萃取2次，每次100 mL，合并乙酸乙酯层，饱和食盐水50 mL洗涤一次，无水硫酸钠干燥30 min后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95：5，收集旋干得到产品1.3 g 中间体I。

在100 mL反应瓶中加入1 mL DMF，在氮气保护下，冰水浴下滴加0.5 mL三氯氧磷，30分钟后滴加含有 0.5 g 中间体I的1,2-二氯乙烷溶液5 mL，逐渐升至常温，加热至90℃ 反应。TLC跟踪，展开剂为:二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后冷却至室温，倒入100 mL冰水中，二氯甲烷萃取2次，每次100 mL，合并二氯甲烷层，饱和食盐水50 mL洗涤一次，无水硫酸钠干燥30 分钟后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=95：5，收集旋干得到产品230 mg中间体II。

100 mL 反应瓶中加入1 g 4-甲基吡啶，5.2 g 环丙烷磺酸，加热至90℃ 搅拌反应。TLC跟踪，展开剂为二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后加入20 mL 乙酸乙酯回流30 分钟后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥12 小时后得到2.1 g 中间体III。

100 mL反应瓶中加入 230 mg中间体II，77 mg 中间体III，3滴六氢哌啶，5 mL甲醇，搅拌，加热至60℃ 反应。TLC跟踪，展开剂为:二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后，旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=91：9，收集旋干得到310 mg 最终产品用于蛋白质定量的荧光染料，附图1为上述产物的质谱图，可以看出，本发明产物结构正确。

中间体I

中间体II

中间体III

实施例二

100 mL 反应瓶中加入0.8 g 3-甲氧基苯胺，2.15 mL 溴代正戊烷，2.24 g 碳酸钾，8 mL二甲基甲酰胺，搅拌，加热至100℃ 反应，TLC跟踪，展开剂为:石油醚:乙酸乙酯=90：10。反应结束后冷却至室温，倒入200 mL清水中，乙酸乙酯萃取2次，每次100 mL，合并乙酸乙酯层，饱和食盐水50 mL洗涤一次，无水硫酸钠干燥30 min后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯=95：5，收集旋干得到产品1.2 g 中间体I。

在100 mL反应瓶中加入1 mL DMF，在氮气保护下，冰水浴下滴加0.7 mL三氯氧磷，30 分装后滴加含有 0.5 g 中间体I的1,2-二氯乙烷溶液5 mL，逐渐升至常温，加热至80℃ 反应。TLC跟踪，展开剂为:二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后冷却至室温，倒入100 mL冰水中，二氯甲烷萃取2次，每次100 mL，合并二氯甲烷层，饱和食盐水50 mL洗涤一次，无水硫酸钠干燥30 分钟后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=95：5，收集旋干得到产品240 mg中间体II。

100 mL 反应瓶中加入1 g 4-甲基吡啶，5.22 g 环庚烷磺酸，加热至100℃ 搅拌反应。TLC跟踪，展开剂为二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后加入20 mL 乙酸乙酯回流30 分钟后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥12 小时后得到2.0 g 中间体III。

100 mL反应瓶中加入 200 mg中间体II，116 mg 中间体III，3滴六氢哌啶，3 mL甲醇，搅拌，加热至65℃ 反应。TLC跟踪，展开剂为:二氯甲烷:甲醇=90：10。反应结束后，旋干，硅胶过柱纯化，淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=91：9，收集旋干得到35 mg 最终产品，化学结构式为表1中的9。附图2为上述产物的质谱图，可以看出，本发明产物结构正确。

根据上述方法，更换原料取代苯胺化合物、溴化合物以及环烷基磺酸，可以得到多种取代基结构的产物，具体见表1，数字为分子量。

表1 本发明的用于蛋白质定量的荧光染料的结构式与分子量

实施例三

本发明制备的用于蛋白质定量的荧光染料具有很强的抗干扰能力，具体结果见表2。

表2 用于蛋白质定量的荧光染料的抗干扰能力

。

实施例四

以BSA（牛血清白蛋白）蛋白质为定量对象，比较本发明用于蛋白质定量的荧光染料与现有常用染料（NanoOrange）的效果。

步骤：

1、准备1×反应缓冲液：1:10 dH₂O稀释两种产品各自的10×缓冲液；

2、准备1×染料工作液：将500×染料（本发明和NanoOrange）分别按1:500用各自的1×反应缓冲液稀释；

3、准备蛋白质标准曲线所需的BSA浓度，如表3所示；

4、避光下，标准蛋白BSA（牛血清白蛋白）加热至90-95℃10分钟，得到样本；

5、取出样本室温避光放置20分钟冷却，短时间离心以收集全部样本；

6、每个标准样品取200 uL 转移到96孔酶标板，制作三重复样本，荧光酶标仪读数。本发明染料激发/发射波长为480/598 nm，NanoOrange激发/发射波长为485/590 nm。

表3 BSA标准浓度

附图3为浓度为0-25 ug/mL的范围内，BSA标准浓度与荧光强度的关系曲线图；如图3所示，NanoOrange在BSA浓度为0-25 ug/mL的范围内，其结果显示出非线性的曲线图（曲线染料），同时重复样本之间的差异明显；而本发明在此检测范围显示出良好的线性度和重现性（直线）。

附图4为浓度为0-1.25 ug/mL的范围内，BSA标准浓度与荧光强度的关系曲线图；如图4所示，在BSA浓度为0-1.25 ug/mL的更小检测范围内，本发明染料（下方）与NanoOrange（上方）检测结果相比，具有更加优秀的线性和重现性。

综上，本发明的用于蛋白质定量的荧光染料除了抗干扰能力强之外（表2），还具有如下优势：（1）信号稳定：NanoOrange蛋白质定量测定荧光信号稳定仅有6小时，而本发明染料则高达16小时；（2）优越的检测范围：NanoOrange检测范围狭窄，仅为0-10 ug/mL，本发明染料检测蛋白浓度的范围增大了2.5倍，检测范围为0.1-25 ug/mL；（3）高线性度：首先在指纹区（0-1.25 ug/mL）范围内，NanoOrange 的线性相关系数R²的值仅在0.92左右，远低于一般认可的0.95（R²越接近1表示线性度越好，只有在小数点之后有两个9以上才被认为线性度好），其次在其整个检测范围内（0-10 ug/mL），线性相关系数R²达不到0.99以上。本发明染料，在整个检测范围以内（0-25 ug/mL），线性相关系数R²的值都在0.99以上。

实施例五

蛋白质标准曲线所需的浓度为0、0.25、0.5、1、1.25、2.5、5、10、15、20，单位ug/mL；染料添加量为每10 uL样本添加250 uL1xWonderOrange工作液；避光下，标准蛋白BSA（牛血清白蛋白），一起加热至90-95℃10分钟，得到样本；取出样本室温避光放置20分钟冷却，短时间离心以收集全部样本；每个标准样品取200 uL 转移到96孔酶标板，制作三重复样本，荧光酶标仪读数，激发/发射波长为480/598 nm。得到的标准曲线方程为y = 82.69x-4.930（纵坐标y为荧光强度，横坐标x为蛋白浓度ug/mL），在整个检测范围以内，线性相关系数R²的值为0.998。

以市售蛋白质为定量对象，验证本发明用于蛋白质定量的荧光染料的效果。待测样本选用市售的两种已知浓度的抗体溶液：80 ug/mL的AF647 Mouse anti-IgM Secondary Antibody(A)和1 mg/mL Mouse anti-Human IgG Secondary Antibody (B)，A样本稀释10倍，B样本稀释100倍，根据上述方法进行测试，五次重复测得A液荧光强度平均值为640.626，B液荧光强度平均值为808.497，分别带入标准曲线方程y=82.69x-4.930；计算得到对应的A和B样本平均浓度分别为7.807 ug/mL以及9.837 ug/mL，由于A样本稀释了10倍，B样本稀释100倍进行检测，故A样本的实际浓度为78.07 ug/mL，B样本的实际浓度为0.9837 mg/mL，与实际浓度非常接近，误差符合标准，故本产品用于检测蛋白浓度是准确可靠的。