一种交联壳聚糖荧光探针材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种交联壳聚糖荧光探针材料及其制备方法与应用。

背景技术：

随着现代社会的发展，环境中重金属污染的问题越来越受到人们的关注。铬是一种危险的重金属元素，是常见的地下水污染物，主要来源于冶金、工业颜料、皮革制剂、木材防护、岩石的风化等。美国环境保护署宣布铬离子是威胁人类健康的金属之一，其在饮用水中的含量不能高于50μg/l。在溶液中，铬元素主要以三价铬(即cr(vi))和六价铬(即cr(iii))的形式存在；三价铬是人体的必需微量元素，对调节糖代谢、维持体内正常的耐量均起着重要作用；而六价铬具有易吸收、高致癌的特性，对人体的呼吸系统、胃、肝、肾等器官都会造成严重损害，因此精确检测出环境中六价铬含量显得至关重要。

传统的铬离子检测分析技术有很多，例如：原子吸收/发射光谱学、电感耦合等离子体质谱分析法、色谱分析法、表面等离子体增强的共振光散射法等，但是这些检测方法普遍存在仪器昂贵、测试时间长、样品需要前处理等缺点，而且这些方法并不适用于原位监测。荧光探针不仅具有高灵敏性、高选择性，而且操作简单，可以用于六价铬的原位监测。但现有技术中的大多数荧光探针敏感性低、光稳定性差、受其他离子干扰性较大，也有些荧光探针合成方法复杂，还有些荧光探针具有高毒性，容易造成环境二次污染，因此现有的荧光探针大多并不能用于实际应用。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种交联壳聚糖荧光探针材料及其制备方法与应用，不仅敏感性高、光稳定性好、受其他离子干扰性小，而且制备方法简单、不会造成环境二次污染。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种交联壳聚糖荧光探针材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤a、按照1g壳聚糖使用700μl冰醋酸和20～800μl质量浓度为25％的戊二醛溶液的比例，将壳聚糖溶于去离子水中，并加入冰醋酸，然后在30℃下搅拌5～100分钟，再加入戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌3～48小时，从而制得待透析溶液；

步骤b、采用纤维素膜对步骤a制得的待透析溶液进行透析，以去除小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后即制得交联壳聚糖荧光探针材料。

优选地，还包括：将步骤b制得的交联壳聚糖荧光探针材料置于4℃下储存。

优选地，步骤b制得的交联壳聚糖荧光探针材料具有蓝色荧光。

一种交联壳聚糖荧光探针材料，采用上述技术方案中所述的交联壳聚糖荧光探针材料的制备方法制备而成。

优选地，上述技术方案中的交联壳聚糖荧光探针材料用于对六价铬进行荧光检测。

优选地，所述的交联壳聚糖荧光探针材料在三价铬离子与六价铬离子共存的条件下选择检测六价铬离子，并且对六价铬离子的检测范围为0.7～500μmol/l，最低检测限为0.0692μmol/l。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料是以壳聚糖和戊二醛为原料，通过醛基与氨基反应，将壳聚糖交联，并采用纤维素膜进行透析处理，从而制得了能产生蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料对水溶液中的六价铬离子具有较好的识别能力，并且具有敏感性高、光稳定性好、受其他离子干扰性小、检测限低等优点，可以用于六价铬离子的检测。而本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料的制备方法不仅合成路线短，合成过程简便、不会造成环境二次污染，而且降低了合成材料对荧光探针的影响，提高了荧光探针的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为本发明实施例1～8所制得的交联壳聚糖荧光探针材料的荧光光谱对比示意图。

图2为本发明实施例4所制得的交联壳聚糖荧光探针材料的紫外吸收光谱、荧光激发光谱和荧光发射光谱示意图。

图3为本发明实施例4所制得的交联壳聚糖荧光探针材料在不同干扰离子存在条件下的荧光强度对比示意图。

图4为本发明实施例4所制得的交联壳聚糖荧光探针材料对不同浓度的六价铬离子进行荧光检测的荧光光谱示意图。

图5为本发明实施例4所制得的交联壳聚糖荧光探针材料对不同浓度的六价铬离子进行三价铬离子存在下的荧光检测的荧光光谱示意图。

图6为对本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料的荧光寿命及加入500μmol/lcr³⁺后的荧光寿命进行检测，从而得到的荧光寿命对比示意图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

下面对本发明提供的交联壳聚糖荧光探针材料及其制备方法与应用进行详细描述。

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a、按照1g壳聚糖使用700μl冰醋酸和20～800μl质量浓度为25％的戊二醛溶液的比例，将壳聚糖溶于去离子水中，并加入冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌5～100分钟(最好是10分钟)，再加入戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌3～48小时(最好是6小时)，从而制得待透析溶液。

步骤b、采用纤维素膜对步骤a制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。在实际应用中，步骤b制得的交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

具体地，本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料可以用于对六价铬进行荧光检测，并且能够在三价铬离子与六价铬离子共存的条件下选择检测六价铬离子，而对六价铬离子的检测范围为0.7～500μmol/l，最低检测限为0.0692μmol/l。

与现有技术相比，本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料至少具有以下优点：

(1)本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料可用于检测六价铬离子，并且该交联壳聚糖荧光探针材料的荧光强度可以通过改变戊二醛的用量来调节，合成方法简便、合成路线短，合成后的材料后处理过程只需要透析处理，不需要其他复杂的工序。

(2)本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料合成条件温和，不需要高温加热处理，因而避免了高温对该交联壳聚糖荧光探针材料的影响。

(3)本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料对六价铬离子具有高度选择性，并且检测时不受三价铬离子的影响，其他离子的加入对其干扰性很小，因此本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料增强了对六价铬离子检测的准确性。

综上可见，本发明实施例不仅敏感性高、光稳定性好、受其他离子干扰性小，而且制备方法简单、不会造成环境二次污染。

为了更加清晰地展现出本发明所提供的技术方案及所产生的技术效果，下面以具体实施例对本发明所提供的交联壳聚糖荧光探针材料及其制备方法与应用进行详细描述。

实施例1

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a1、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入20μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b1、采用纤维素膜对步骤a1制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例2

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a2、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入50μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b2、采用纤维素膜对步骤a2制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例3

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a3、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入100μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b3、采用纤维素膜对步骤a3制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例4

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a4、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入200μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b4、采用纤维素膜对步骤a4制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例5

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a5、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入300μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b5、采用纤维素膜对步骤a5制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例6

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a6、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入400μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b6、采用纤维素膜对步骤a6制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例7

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a7、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入600μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b7、采用纤维素膜对步骤a7制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

实施例8

一种交联壳聚糖荧光探针材料，其制备方法包括以下步骤：

步骤a8、将1g壳聚糖溶于去离子水中，待其均匀分散后，加入700μl冰醋酸，然后在30℃恒温条件下搅拌10分钟，再加入800μl质量浓度为25％的戊二醛溶液，在30℃下继续搅拌6小时，从而制得待透析溶液。

步骤b8、采用纤维素膜对步骤a8制得的待透析溶液进行透析，以去除未反应的小分子，截留分子量为14kd，透析时间为24小时，每8小时换一次水，透析结束后，将溶液倒出即制得具有蓝色荧光的交联壳聚糖荧光探针材料。该交联壳聚糖荧光探针材料最好置于4℃下储存。

性能检测

对上述本发明实施例1～8中制得的交联壳聚糖荧光探针材料进行以下性能检测：

(1)对本发明实施例1～8中制得的交联壳聚糖荧光探针材料进行荧光光谱检测，从而得到如图1所示的荧光光谱对比示意图。在图1中，“20μl”表示制备过程中采用20μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例1)，“50μl”表示制备过程中采用50μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例2)，“100μl”表示制备过程中采用100μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例3)，“200μl”表示制备过程中采用200μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例4)，“300μl”表示制备过程中采用300μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例5)，“400μl”表示制备过程中采用400μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例6)，“600μl”表示制备过程中采用600μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例7)，“800μl”表示制备过程中采用800μl戊二醛溶液的实施例(即本发明的实施例8)。由图1可以看出：当戊二醛溶液的用量从20μl增加至200μl时，交联壳聚糖荧光探针材料的荧光强度逐渐增强，但当戊二醛溶液的用量从300μl增加至800μl，交联壳聚糖荧光探针材料的荧光强度反而逐渐降低，因此下述实验中选取戊二醛溶液的用量为200μl(即本发明的实施例4)进行检测，此时交联壳聚糖荧光探针材料的荧光达到最大。

(2)对本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料进行紫外吸收光谱、荧光激发光谱和荧光发射光谱的检测，从而得到如图2所示的紫外吸收光谱、荧光激发光谱和荧光发射光谱示意图。由图2可以看出：所述交联壳聚糖荧光探针材料有两个吸收峰259nm和295nm，分别归因于席夫碱的c＝n,c＝o双键的n-π*过渡和共轭c＝c双键的π-π*过渡；其最大激发波长和发射波长分别为366nm和448nm，82nm的斯托克斯位移可以容易的区分激发波长与发射波长。

(3)采用本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料进行对六价铬离子的选择性实验和抗其他离子干扰性实验，其具体实验方法如下：采用nah2po4·2h2o和na2hpo4·12h2o配制多份10mmol/lph＝6.5的pbs缓冲溶液作为检测液，然后向每份检测液中均加入一定体积的本发明实施例4制得的交联壳聚糖荧光探针材料，并分别向检测液中加入浓度均为200μmol/l的cu²⁺、cd²⁺、pb²⁺、fe³⁺、co²⁺、ni²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、al³⁺、cr³⁺、ag⁺、nh4⁺、cl^-、i^-和no^2-中的一种，再向每份检测液中加入浓度为200μmol/l的cr⁶⁺，最终将每份检测液定容至4ml，并且其中所述交联壳聚糖荧光探针材料的浓度为2.655mg/ml；采用波长为366nm的激发光分别测定每份检测液在未加入六价铬离子与加入六价铬离子时的荧光光谱，从而得到如图3所示的不同干扰离子存在下的荧光强度对比示意图。由图3可以看出：cr⁶⁺的加入可使所述交联壳聚糖荧光探针材料的荧光显著淬灭，其他常见的离子(cu²⁺、cd²⁺、pb²⁺、fe³⁺、co²⁺、ni²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ca²⁺、mg²⁺、al³⁺、cr³⁺、ag⁺、nh4⁺、cl^-、i^-和no^2-)对所述交联壳聚糖荧光探针材料的荧光光谱影响很小；这一结果表明：在10mmol/lph＝6.5的pbs缓冲溶液中，2.655mg/ml的交联壳聚糖荧光探针材料对cr⁶⁺有较高的选择性，而且证明该交联壳聚糖荧光探针材料检测cr⁶⁺不受其他常见共存离子的干扰。

(4)采用本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料对不同浓度的六价铬离子的荧光检测实验，其具体实验方法如下：采用nah2po4·2h2o和na2hpo4·12h2o配制多份10mmol/lph＝6.5的pbs缓冲溶液作为检测液，然后向每份检测液中均加入一定体积的本发明实施例4制得的交联壳聚糖荧光探针材料，并分别按照浓度为0μmol/l、0.7μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、6μmol/l、8μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、50μmol/l、70μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l和500μmol/l向检测液中加入cr⁶⁺，最终将每份检测液定容至4ml，并且其中所述交联壳聚糖荧光探针材料的浓度为2.655mg/ml；采用波长为366nm的激发光分别测定每份检测液的荧光光谱，从而得到如图4所示的不同浓度的六价铬离子的荧光光谱示意图。由图4可以看出：随着cr⁶⁺浓度的增加，所述交联壳聚糖荧光探针材料的荧光强度逐渐降低；当cr⁶⁺浓度范围在0.7～100μmol/l内时，该交联壳聚糖荧光探针材料的最大荧光强度与cr⁶⁺浓度呈较好的线性关系；据此计算得到该交联壳聚糖荧光探针材料检测cr⁶⁺的检测限为0.0692μmol/l，由于该交联壳聚糖荧光探针材料的最大荧光强度与cr⁶⁺浓度呈较好的线性关系，有利于根据实际需求设定来进行cr⁶⁺的定量检测，保证检测更准确。

(5)采用本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料对不同浓度的六价铬离子进行三价铬离子存在下的荧光检测实验，其具体实验方法如下：采用nah2po4·2h2o和na2hpo4·12h2o配制多份10mmol/lph＝6.5的pbs缓冲溶液作为检测液，然后向每份检测液中均加入一定体积的本发明实施例4制得的交联壳聚糖荧光探针材料和一定体积的cr³⁺，然后分别按照浓度为0μmol/l、0.7μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、6μmol/l、8μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、50μmol/l、70μmol/l、100μmol/l、150μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l和500μmol/l向检测液中加入cr⁶⁺，最终将每份检测液定容至4ml，并且其中所述交联壳聚糖荧光探针材料的浓度为2.655mg/ml，cr³⁺的浓度为200μmol/l；采用波长为366nm的激发光分别测定每份检测液的荧光光谱，从而得到如图5所示的不同浓度的六价铬离子在三价铬离子存在下的荧光光谱示意图。由图5可以看出：当溶液中cr³⁺的浓度均为200μmol/l时，交联壳聚糖荧光探针材料的荧光强度依然随着cr⁶⁺浓度的增加而降低，表现出与图4中相一致的淬灭现象。由此说明无论溶液中cr³⁺存在与否，均不会对交联壳聚糖荧光探针材料检测cr⁶⁺产生干扰。

(6)对本发明实施例4中制得的交联壳聚糖荧光探针材料的荧光寿命及加入500μmol/lcr³⁺后的荧光寿命进行检测，从而得到如图6所示的荧光寿命对比示意图；图中的m即为mol/l。由图6可以看出：当加入500μmol/lcr⁶⁺后，交联壳聚糖荧光探针材料的荧光寿命从8.58ns衰减到7.22ns，由此可以得出交联壳聚糖荧光探针材料与cr⁶⁺之间的淬灭为动态淬灭。

综上可见，本发明实施例不仅敏感性高、光稳定性好、受其他离子干扰性小，而且制备方法简单、不会造成环境二次污染。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。