一种氮掺杂碳量子点及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种氮掺杂碳量子点、氮掺杂碳量子点的制备方法和用途，以及包含该氮掺杂碳量子点的药物组合物，属于纳米材料和生物医用材料技术领域。

背景技术：

核酸药物由于其特定的靶点和作用机制，在抗肿瘤、抗感染、心血管系统疾病、神经系统疾病、代谢失调、炎症、免疫治疗，以及传统的小分子药物无法发挥治疗作用的疾病和罕见病等治疗中已显示出巨大的应用潜力。然而，核酸药物带有负电荷，使其无法穿透细胞膜并发挥相应的作用，核酸药物向细胞内的高效递送仍然是一个巨大的挑战。开发安全、有效的药物递送载体，以实现核酸药物的体内高效递送，是目前亟待解决的重要问题。

碳量子点首先在纯化单壁碳纳米管的过程中作为副产物被发现。经过十几年发展，人们已经开发了多种碳量子点的制备方法，主要分为“自上而下”法和“自下而上”法。“自上而下”的方法分解纳米金刚石、石墨、碳黑以及氧化石墨等大分子碳材料，把其破碎成碳纳米颗粒，涉及到的方法包括电弧放电、电化学氧化和激光刻蚀法等。“自下而上”的方法从小分子前驱物作为碳材料，经过燃烧或热处理合成碳量子点，涉及微波法、水热法、热解法等。由于碳量子点具有独特的光学、电化学和物理化学性质，使其在生物成像、药物递送、光热/光动力治疗，以及纳米传感器和响应性纳米材料等领域获得广泛应用。其中，以碳量子点作为核酸药物的递送载体显示出较大的应用潜力。

中国专利文献cn109135737a公开了一种由多糖化合物与阳离子聚合物制备的氮掺杂碳量子点的制备方法，即以多糖化合物作为碳源，加入阳离子聚合物作为氮源，溶解于溶剂中，得到前躯体溶液，将前躯体溶液转移至密闭容器中反应，反应完成后，冷却至室温得到悬浊液，用透析法分离，冻干，得到氮掺杂碳量子点。其中多糖化合物为壳聚糖、索拉胶和纤维素中的一种或几种，阳离子聚合物为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺。该方法制备的氮掺杂碳量子点可实现对基因的递送。

聚乙烯亚胺的分子链中带有大量氨基，是一种具有较高转染效率的阳离子聚合物。上述引用文献以多糖化合物和聚乙烯亚胺为前驱体合成碳量子点，壳聚糖、索拉胶、纤维素等均是不含有或少量含有羧基基团的化合物，难以与含有大量氨基基团的聚乙烯亚胺形成稳定的化学键连接。因此，在得到的氮掺杂碳量子点中，聚乙烯亚胺主要以嵌合或由游离的方式存在于碳量子点的表面。一方面，游离的聚乙烯亚胺细胞毒性较大，会降低氮掺杂碳量子点的生物安全性；另一方面，聚乙烯亚胺以游离或嵌合的方式存在于碳量子点上，导致氮掺杂碳量子点的稳定性不足，上述氮掺杂碳量子点作为核酸递送载体，仅是用于向细胞内递送具有良好稳定性的dna、质粒。与dna相比，rna的稳定性差，在递送过程中功能易丧失。因此，目前仍需要生物相容性好、细胞毒性低、对dna及rna类的核酸均能实现高效递送的碳量子点。

技术实现要素：

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的技术问题，例如：碳量子点的稳定性不足，缺少能够同时高效递送dna以及rna的碳量子点的问题。本发明首先提供了一种氮掺杂碳量子点，其稳定性好，能够向细胞内高效递送dna和rna，氮掺杂碳量子点的生物相容性好，细胞毒性低。

进一步地，本发明还提供了氮掺杂碳量子点的制备方法，该制备方法简单易行，制备过程绿色环保，降低了生产成本，适于氮掺杂碳量子点的工业化生产。

进一步地，本发明还提供了氮掺杂碳量子点在制备药物递送载体中的应用，能够作为dna以及rna类核酸药物的递送载体，发挥其药物治疗效果。

用于解决问题的方案

本发明首先提供了一种氮掺杂碳量子点，所述氮掺杂碳量子点的原料包括壳聚糖类物质和氨基酸；优选地，所述壳聚糖类物质和氨基酸的质量比为10:1～1:10。

根据本发明的氮掺杂碳量子点，其中，所述壳聚糖类物质包括壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；优选地，所述壳聚糖衍生物包括甲壳素、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖盐酸盐、乙二醇壳聚糖和几丁糖中的至少一种。

根据本发明的氮掺杂碳量子点，其中，所述氨基酸包括脂肪族氨基酸、亚氨基酸、芳香族氨基酸、羟基类氨基酸、含硫类氨基酸、酰胺类氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸中的至少一种；

优选地，所述氨基酸为碱性氨基酸；优选地，所述碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的至少一种。

根据本发明的氮掺杂碳量子点，其中，所述氮掺杂碳量子点的原料还包括聚乙烯亚胺；优选地，所述壳聚糖类物质与所述聚乙烯亚胺的质量比为10:1～1:10。

根据本发明的氮掺杂碳量子点，其中，所述氮掺杂碳量子点的粒径为1～20nm，表面电势为+3～+40mv。

本发明还提供了一种根据本发明所述的氮掺杂碳量子点的制备方法，其包括：

混合步骤：将所述壳聚糖类物质和氨基酸，与任选存在的聚乙烯亚胺混合，获得前驱体溶液；

合成步骤：对所述前驱体溶液进行水热处理或微波处理，获得所述氮掺杂碳量子点。

根据本发明的制备方法，其中，

所述水热处理的温度为130～260℃，反应时间为1～12h，搅拌速度为0～1200rpm；

所述微波处理的功率为600～1000w，反应时间为5～60min。

根据本发明的制备方法，其中，所述混合步骤包括，将所述壳聚糖类物质和氨基酸与任选存在的聚乙烯亚胺在水或酸溶液中混合，以获得所述前驱体溶液；优选地，所述混合步骤还包括，对所述前驱体溶液进行加热或超声处理。

根据本发明的制备方法，其中，所述酸溶液由酸性物质溶于溶剂获得，所述酸性物质包括乙酸、氯化氢、甲酸、硝酸、硫酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸中的至少一种；优选地，所述酸溶液中，所述酸性物质与所述溶剂的质量比为0.5:99.5～3:97。

根据本发明的制备方法，其中，还包括：

纯化步骤：在所述合成步骤之后，提纯所述水热处理或微波处理的溶液，然后将提纯的溶液冻干，获得纯化的氮掺杂碳量子点；

可选地，所述提纯处理选自离心、过滤、透析、超滤、切向流和层析中的至少一种。

根据本发明所述的氮掺杂碳量子点，或者根据本发明所述的方法制备的氮掺杂碳量子点在制备药物递送载体中的用途。

根据本发明的用途，其中，所述药物递送载体为核酸药物的递送载体；优选地，所述氮掺杂碳量子点结合核酸药物后，制作为干粉剂、喷雾剂或注射剂。

本发明还提供了一种药物组合物，其中，包括根据本发明所述的氮掺杂碳量子点，或者根据本发明所述的方法制备的氮掺杂碳量子；优选地，所述药物组合物还包括核酸药物；优选地，所述药物组合物为干粉剂、喷雾剂或注射剂。

发明的效果

本发明的氮掺杂碳量子点，以壳聚糖类物质和氨基酸为原料，壳聚糖类物质具有较高的正电荷密度，能够得到表面电势为正的氮掺杂碳量子点，可以结合带有负电荷的核酸药物。氮掺杂碳量子点以天然生物材料壳聚糖类物质和氨基酸为原料，具有高的生物相容性和低的细胞毒性。氨基酸带有的氨基基团和羧基基团可以使其形成酰胺键结合于碳量子点上，使氮掺杂碳量子点具有较高的稳定性，结合核酸后可保持核酸结构完整性，实现对dna以及rna类核酸药物的高效递送，使核酸药物进入细胞后充分发挥药物治疗效果。

进一步地，本发明的氮掺杂碳量子点，其原料还包含聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺可以通过氨基酸形成酰胺键稳定结合于碳量子点上，获得高稳定性的氮掺杂碳量子点，并且进一步提高了氮掺杂碳量子点递送dna和rna的效率。另一方面，聚乙烯亚胺以化学键合的方式连接于碳量子点上，可以降低游离聚乙烯亚胺的细胞毒性，获得高生物相容性、低细胞毒性的氮掺杂碳量子点。

进一步地，本发明的氮掺杂碳量子点的制备方法，该制备方法简单易行，制备过程绿色环保，降低了生产成本，适于大批量制备高效递送dna和rna的氮掺杂碳量子点，满足工业化生产需求。

进一步地，本发明的氮掺杂碳量子点在制备药物递送载体中的应用，能够作为dna以及rna类核酸药物的递送载体，发挥核酸药物的治疗效果。

附图说明

图1示出了实施例1中氮掺杂碳量子点的粒径分布及tem图，图中标尺为50nm；

图2示出了实施例2中氮掺杂碳量子点的tem图，图2-a是标尺为20nm的tem图，图2-b是标尺为5nm的tem图；

图3示出了实施例3中三组氮掺杂碳量子点的紫外吸光度值；

图4示出了实施例4中十一组氮掺杂碳量子点的荧光发射光谱图，激发波长为350nm；

图5示出了实施例12中氮掺杂碳量子点与核酸结合后的琼脂糖凝胶电泳实验结果；

图6示出了实施例13中氮掺杂碳量子点与a549细胞共孵育2小时后氮掺杂碳量子点在细胞中的分布情况，图中标尺为20μm；

图7示出了实施例14中核酸引物在与a549细胞共孵育4小时的细胞内分布情况，图中标尺为50μm；

图8示出了实施例15中质粒dna在12小时后在293t细胞内egfp的表达情况，其中图8-a为egfp表达荧光图片，图8-b为细胞明场分布图，图中标尺为200μm；

图9示出了实施例16中质粒dna在72小时后在293t细胞内egfp的表达情况，图中标尺为200μm；

图10示出了实施例17中mrna在24小时后在293t细胞内egfp的表达情况，图中标尺为100μm；

图11示出了实施例18中质粒dna在48小时后在293t细胞内egfp的表达情况，图中标尺为100μm。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。

另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等化妆品领域能够使用的任何可行的水。

第一方面

本发明的第一方面提供了一种氮掺杂碳量子点，所述氮掺杂碳量子点的原料包括：壳聚糖类物质和氨基酸。

本发明的氮掺杂碳量子点，以壳聚糖类物质和氨基酸作为碳源及氮源，得到的碳量子点表面电势为正，能够结合核酸将其递送至细胞内，氨基酸能够形成酰胺键结合于碳量子点上，使氮掺杂碳量子具有较好的稳定性。本发明在研究中发现，以壳聚糖类物质和氨基酸为原料的氮掺杂碳量子点在递送核酸时能够保持核酸结构的完整，使核酸进入细胞内后发挥其功效，实现对dna与rna的有效递送，且具有递送效率高、生物相容性高、细胞毒性低的优势。

作为优选，所述壳聚糖类物质和氨基酸的质量比为10:1～1:10。举例而言，壳聚糖类物质和氨基酸的质量比可以是10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4，1:6，1:8等等。当壳聚糖类物质和氨基酸的质量比为10:1～1:10时，得到所需c、n比例的氮掺杂碳量子点，且量子点的粒径均一、分散度高，适于向细胞内递送dna和rna的氮掺杂碳量子点，并能够实现氮掺杂碳量子点的荧光光学特性。

在本发明中，壳聚糖类物质是天然的高分子，其主要元素组成为碳，且分子链上含有大量的带正电荷的氨基基团，能够作为合成氮掺杂碳量子点的碳源物质，也可作为碳量子点的钝化剂，适于制备表面电势为正的碳量子点。进一步地，壳聚糖类物质包括壳聚糖和/或壳聚糖衍生物。

在一些具体的实施方案中，壳聚糖衍生物包括甲壳素、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖盐酸盐、乙二醇壳聚糖和几丁糖中的至少一种。壳聚糖是一种天然的生物多糖，具有优异的生物学功能并能进行化学修饰，得到上述多种壳聚糖衍生物。壳聚糖及壳聚糖衍生物具有较好的生物相容性及生物可降解性，可提高氮掺杂碳量子点递送核酸药物的安全性，在完成递送后可降解代谢。

在本发明中，氨基酸含有氨基基团和羧基基团，是构成生物体中蛋白质的主要单元。以氨基酸作为原料合成氮掺杂碳量子点，不仅可使得到的氮掺杂碳量子点具有高的生物相容性和低的毒性，还可以利用氨基酸的氨基、羧基基团形成酰胺键结合于碳量子点表面，使氮掺杂碳量子点的稳定性大大提高。

进一步的，所述氨基酸包括脂肪族氨基酸、亚氨基酸、芳香族氨基酸、羟基类氨基酸、含硫类氨基酸、酰胺类氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸中的至少一种。其中，脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中的至少一种。亚氨基酸为脯氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的至少一种。羟基类氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸中的至少一种。含硫类氨基酸包括半胱氨酸和蛋氨酸中的至少一种。酰胺类氨基酸包括天冬酰胺和谷氨酰胺中的至少一种。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种。碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的至少一种。

在一些优选的实施方案中，所述氨基酸为碱性氨基酸。碱性氨基酸是一类在ph中性时等电点为9.74～10.76的氨基酸，其主要组成亦为碳，分子链上带有一个氨基基团和一个胍基基团，可作为合成碳量子点的碳源和钝化剂，并在碳量子点中掺杂氮元素。

进一步的，碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的至少一种。精氨酸、赖氨酸和组氨酸作为天然生物材料，目前已被证实能够提高机体免疫力，促进免疫系统分泌自然杀伤细胞、吞噬细胞、白血球内烯素等内生性物质，以对抗癌细胞、预防病毒感染等，是优异的医用材料。

在一些具体的实施方案中，氮掺杂碳量子点的原料还包括聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，pei)又称聚氮杂环丙烷，是一种水溶性高分子聚合物，因其分子链带有大量氨基，可用于核酸转染。聚乙烯亚胺生物可作为合成氮掺杂碳量子的氮源材料，提高氮掺杂碳量子点向细胞内的摄入率。此外，聚乙烯亚胺利用氨基酸形成酰胺键结合于碳量子点上，有利于提高氮掺杂碳量子点的稳定性，还可降低聚乙烯亚胺的毒性。

具体地，所述壳聚糖类物质与所述聚乙烯亚胺的质量比为10:1～1:10，举例而言，壳聚糖类物质和聚乙烯亚胺的质量比可以是8:1，6:1，4:1，2:1，4:3，1:1，1:2，1:2.5，1:4，1:6，1:8等等。通过添加聚乙烯亚胺可以提高氮掺杂碳量子点对核酸的递送效率，若其比例低于1:10则递送效率提高效果不明显；若比例高于1:10，聚乙烯亚胺会带来较高的细胞毒性。作为优选，聚乙烯亚胺的分子量为600～25000da。

在一些具体的实施方案中，氮掺杂碳量子点的粒径为1～20nm，表面电势为+3～+40mv。氮掺杂碳量子点表面电势为+3～+40mv，可与带有负电荷的核酸药物结合，并具有较好的化学稳定性；氮掺杂碳量子点的粒径为1～20nm，可保证氮掺杂碳量子点结合核酸药物后向细胞内的摄入。

第二方面

本发明的第二方面提供第一方面所述的氮掺杂碳量子点的制备方法，其包括：

混合步骤：将所述壳聚糖类物质和氨基酸，与任选存在的聚乙烯亚胺混合，获得前驱体溶液；

合成步骤：对所述前驱体溶液进行水热处理或微波处理，获得所述氮掺杂碳量子点。

本发明的制备方法，以壳聚糖类物质、氨基酸和任选存在的聚乙烯亚胺作为前驱物，经水热处理或微波处理，得到氮掺杂碳量子点。该制备方法简单易行，制备过程绿色环保，降低了生产成本，适于大批量制备高效递送dna和rna的氮掺杂碳量子点，满足工业化生产需求。

在本发明中，混合步骤包括，将所述壳聚糖类物质和氨基酸与任选存在的聚乙烯亚胺在水或酸溶液中混合，以获得所述前驱体溶液。在一些具体的实施方案中，前驱体溶液由壳聚糖类物质和氨基酸在水或酸溶液中混合得到。在另外一些具体的实施方案中，前驱体溶液由壳聚糖类物质和氨基酸，以及聚乙烯亚胺在水或酸溶液中混合得到。作为优选，前驱体溶液中壳聚糖类物质的浓度为0.5～30mg/ml。

在一些具体的实施方案中，将所述壳聚糖类物质和氨基酸与任选存在的聚乙烯亚胺在酸溶液中混合。对于酸溶液，可以是将酸性物质溶于溶剂中得到，本发明对具体的溶剂不作特别限定，可以是本领域常用的极性溶剂，例如：水等。进一步地，酸性物质包括乙酸、盐酸、甲酸、硝酸、硫酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸中的至少一种。进一步地，所述酸溶液中，所述酸性物质与所述溶剂的质量比为0.5:99.5～3:97。

在另外一些具体的实施方案中，将所述壳聚糖类物质和氨基酸与任选存在的聚乙烯亚胺在水中混合，同样能够实现对氮掺杂碳量子点的水热法或微波法合成。

作为优选，所述混合步骤还包括，对所述前驱体溶液进行加热或超声处理。通过加热或超声处理，可促使壳聚糖类物质、氨基酸、聚乙烯亚胺在水或酸溶液中充分溶解。

在本发明中，对所述前驱体溶液进行水热处理或微波处理，使前驱体物质的性能进行整合，并合成为氮掺杂碳量子点。具体的，对于水热处理，处理的温度为130～260℃，反应时间为1～12h，搅拌速度为0～1200rpm；优选在水热反应釜中进行，可同时提供水热反应所需的温度，并对前驱体溶液进行搅拌。对于微波处理，处理的功率为600～1000w，反应时间为5～60min。本发明在研究中发现，在130～260℃的温度范围内，随着对前驱体溶液处理温度的提升，能够得到紫外吸光度值和荧光强度均提升的氮掺杂碳量子点。

进一步地，本发明的制备方法还包括纯化步骤：在所述合成步骤之后，提纯所述水热处理或微波处理的溶液，然后将提纯的溶液冻干，获得纯化的氮掺杂碳量子点。纯化的氮掺杂碳量子点直接用于dna及rna的递送，作为核酸药物的递送载体。

具体地，提纯处理选自离心、过滤、透析、超滤、切向流和层析中的至少一种。作为优选，提纯时离心速度为3000～30000rpm，时间为5～60min；过滤选用0.22或0.45μm针头过滤器；透析选用1～5kda的透析膜，透析时间为8～72h。

第三方面

本发明的第三方面提供第一方面所述的氮掺杂碳量子点，或以第二方面所述的方法制备的氮掺杂碳量子点在制备药物递送载体中的用途。

进一步地，药物递送载体为核酸药物的递送载体，氮掺杂碳量子点可以结合dna、rna，向细胞内高效递送核酸，并且保持核酸结构完整，使dna、rna的核酸药物进入细胞内后能够充分发挥药物疗效。

作为优选，氮掺杂碳量子点结合核酸药物后，制作为干粉剂、喷雾剂或注射剂。

进一步地，本发明的第三方面还提供了一种药物组合物，包括第一方面所述的氮掺杂碳量子点，或以第二方面所述的方法制备的氮掺杂碳量子点。进一步，药物组合物还包括核酸药物。由于选择了能够结合并高效递送的dna、rna的氮掺杂碳量子点，药物组合物具有较好的药物治疗价值和应用潜力。作为优选，药物组合物为干粉剂、喷雾剂或注射剂。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖和0.01g精氨酸，将其加入到20ml1％的乙酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至140℃，反应时间2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，收集含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

以马尔文的激光粒度仪观测氮掺杂碳量子点的粒径及zeta电位，结果如图1所示，该氮掺杂碳量子点的平均粒径为6.1nm，zeta电位为+3.3mv。

实施例2

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖和0.3g精氨酸，将其加入到20ml2％的乙酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至150℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用0.22μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

图2显示氮掺杂碳量子点的tem图，该氮掺杂碳量子点的平均粒径为4.9nm，zeta电位为+4.7mv。

实施例3

本实施例测试不同水热处理温度下氮掺杂碳量子点的紫外吸光度，包括以下步骤：

(1)称取0.3g壳聚糖和0.03g精氨酸，将其加入到60ml1％的乙酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液分三份，转移至高温高压反应釜中，分别加热至130、135、140℃，时间2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，取三组过滤液稀释100倍后使用紫外分光光度计测量三组氮掺杂碳量子点紫外吸光度值。

图3显示本实施例中三组氮掺杂碳量子点的紫外吸光度值。从图中可以看到，其他条件不变，随着反应温度的升高，得到的氮掺杂碳量子点的紫外吸光度值越大。

实施例4

本实施例测试不同提供不同水热处理温度下氮掺杂碳量子点的荧光强度，包括以下步骤：

(1)称取1.1g壳聚糖和3.3g精氨酸，将其加入到220ml2％的乙酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液分十一份，转移至高温高压反应釜中，分别加热至130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230℃，时间2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，稀释100倍后使用荧光分光光度计测量十一组氮掺杂碳量子点荧光度值。

图4显示本实施例中十一组氮掺杂碳量子点的荧光发射光谱图，激发波长为350nm。从图中可以看到，其他条件不变，随着反应温度的升高，得到的氮掺杂碳量子点荧光强度越大。

实施例5

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖和0.3g精氨酸，将其加入到20ml1％的乙酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至150℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

氮掺杂碳量子点平均粒径为3.1nm，zeta电位为+14.5mv。

实施例6

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.2g羧甲基壳聚糖和1.5g赖氨酸，将其加入到100ml3％的抗坏血酸水溶液中，水浴70℃加热溶解。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，微波炉中微波45min，900w。

(3)反应结束后取出混合液，使用3kda透析膜透析12h，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.45μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

实施例7

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.2g乙二醇壳聚糖和1.5g组氨酸，将其加入到30ml3％的甲酸水溶液中，水浴70℃加热溶解。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，微波炉中微波30min，1000w。

(3)反应结束后取出混合液，使用1kda透析膜透析48h，得到含有碳量子点的上清液，然后使用层析法分离，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

实施例8

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖和0.3g精氨酸，将其加入到20ml0.5％的盐酸水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至195℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

氮掺杂碳量子点平均粒径为22.6nm，zeta电位为+22.6mv。

实施例9

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.0g壳聚糖季铵盐和1.0g精氨酸，将其加入到20ml水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至195℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用超速离心机离心15000rpm，30min，得到含有碳量子点的上清液，然后使用0.22μm针头滤器过滤，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

氮掺杂碳量子点平均粒径为5.9nm，zeta电位为+9.3mv。

实施例10

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖季铵盐、0.3g精氨酸和0.25gpei(分子量1.8kda)，将其加入到20ml水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至195℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用0.22μm针头滤器过滤，切向流浓缩、清洗碳量子点溶液，得到含有碳量子点的上清液，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

氮掺杂碳量子点平均粒径为16.8nm，zeta电位为+9.8mv。

实施例11

本实施例提供一种氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.1g壳聚糖季铵盐、0.3g精氨酸和0.075gpei(分子量25kda)，将其加入到20ml水溶液中，超声10分钟，功率为250w。

(2)将上述溶液转移至高温高压反应釜中，加热至195℃，反应2h，转速为800rpm。

(3)反应结束后取出混合液，使用0.22μm针头滤器过滤，切向流浓缩、清洗碳量子点溶液，得到含有碳量子点的上清液，然后放入液氮中冷冻，转入冻干机冷冻干燥48小时，得到氮掺杂碳量子点。

氮掺杂碳量子点平均粒径为2.8nm，zeta电位为+10.5mv。

实施例12

本实施例测试不同质量比的氮掺杂碳量子点与dna的结合效果，将实施例5中的氮掺杂碳量子点与dna按不同质量比结合，结合方式为室温下孵育30min，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验。

图5为琼脂糖凝胶电泳实验结果，从左至右分别为marker、freedna、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:20、1:50(上述比例为氮掺杂碳量子点与dna质量比)。从图中可以看到，在氮掺杂碳量子点与dna质量比大于1:1时，碳量子点可以与核酸紧密的结合在一起；当比例小于1:1时，碳量子点无法结合所有的核酸，使得部分核酸跑出。

实施例13

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内的摄入情况，步骤如下：

首先将a549细胞铺在24孔板中(接种密度1.0×10⁵个/孔)。等细胞长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl实施例5中的氮掺杂碳量子点，放入培养箱中培养。共同孵育2小时后，pbs清洗三遍，通过荧光显微镜拍摄碳量子点进入细胞情况，图6为氮掺杂碳量子点在2小时后细胞内分布情况。从图中可以看到，氮掺杂碳量子点在2小时内成功进入细胞，且未进入细胞核。

实施例14

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内递送核酸引物的情况，步骤如下：

将实施例5中的氮掺杂碳量子点与cy3标记的核酸引物室温孵育30min。将a549细胞铺在24孔板中(接种密度1.0×10⁵个/孔)。等细胞贴壁长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl上述混合液，放入培养箱中培养。共同孵育4小时后，pbs清洗三遍，通过荧光显微镜拍摄核酸引物进入细胞情况，图7为核酸引物在4小时后细胞内分布情况。从图中可以看到，核酸引物在2小时内成功进入细胞，且未进入细胞核。

实施例15

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内递送质粒dna的情况，步骤如下：

将实施例8中的氮掺杂碳量子点与含有egfp的质粒dna室温孵育30min。将293t细胞按接种密度1.0×10⁵个/孔接种到24孔板中过夜。等细胞贴壁长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl上述氮掺杂碳量子点与质粒dna的混合液，放入培养箱中培养。通过荧光显微镜拍摄质粒dna在细胞内表达情况，图8为质粒dna在24小时后egfp在细胞内表达情况，其中图8-a为egfp表达荧光图片，图8-b为细胞明场分布图。从图中可以看到，质粒dna在24小时内成功进入细胞并表达。

实施例16

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内递送质粒dna的情况，步骤如下：

将实施例9中的氮掺杂碳量子点与含有egfp的质粒dna室温孵育30min。将293t细胞按接种密度1.0×10⁵个/孔接种到24孔板中过夜。等细胞贴壁长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl上述氮掺杂碳量子点与质粒dna的混合液，放入培养箱中培养。通过荧光显微镜拍摄质粒dna在细胞内表达情况，图9为质粒dna在72小时后egfp在细胞内表达情况。从图中可以看到，质粒dna在72小时内成功进入细胞并表达。

实施例17

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内递送mrna的情况，步骤如下：

将实施例10中的氮掺杂碳量子点与表达egfp的mrna室温孵育15min。将293t细胞按接种密度1.0×10⁵个/孔接种到24孔板中过夜。等细胞贴壁长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl上述氮掺杂碳量子点与mrna的混合液，放入培养箱中培养。通过荧光显微镜拍摄mrna在细胞内表达情况，图10为mrna在24小时后egfp在细胞内表达情况。从图中可以看到，mrna在24小时内成功进入细胞并表达。

实施例18

本实施例测试氮掺杂碳量子点向细胞内递送质粒dna的情况，步骤如下：

将实施例11中的氮掺杂碳量子点与含有egfp的质粒dna室温孵育30min。将293t细胞按接种密度1.0×10⁵个/孔接种到24孔板中过夜。等细胞贴壁长到70-80％时，将旧培养基弃掉，用2mlpbs清洗三次，加入450μl不含fbs的培养基，再加入50μl上述氮掺杂碳量子点与质粒dna的混合液，放入培养箱中培养。通过荧光显微镜拍摄质粒dna在细胞内表达情况，图11为质粒dna在48小时后egfp在细胞内表达情况。从图中可以看到，质粒dna在48小时内成功进入细胞并表达。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。