由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用

由染料分子标记的四嗪探针及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针。本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应在常温、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗪探针之间的偶联反应后，通过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。本发明还提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，该方法简单易行，可以进行大规模生产，且生产成本低。本发明还提供了一种胆碱类似物以及由染料分子标记的四嗪探针的应用。
【专利说明】由染料分子标巧的四瞎探针及其制备方法和应用
[0001] 本申请是针对于2013年12月31日提交到中国专利局、申请号为201310752617.4、 发明名称为"胆碱类似物及其制备方法和应用、由染料分子标记的四嗦探针及其制备方法 和应用"的母案申请作出的分案申请，上述母案申请的内容W引入的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明设及生物医药材料领域，具体设及胆碱类似物及其制备方法和应用、由染 料分子标记的四嗦探针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003] 胆碱(化0)是细胞膜结构和脂蛋白构成上的重要组成部分。在真核生物中，憐脂头 端最普遍的基团是胆碱，含憐脂胆碱是细胞膜中最丰富的憐脂，也是细胞膜的主要结构成 分，在细胞代谢和信号传导中起着至关重要的作用，
[0004] A化ian Salic课题组利用胆碱在细胞中的代谢途径，通过对胆碱的末端修饰烘 基，在不影响其功能的前提下实现了其对细胞的原位标记，并用带叠氮的染料通过click铜 催化对细胞内胆碱的代谢行为进行示踪分析。然而，在该方法采用的是传统叠氮-烘基 Husigen[3+3]环加成反应，催化剂铜的存在会引起细胞的毒性，因而在活细胞乃至活体的 应用中受到很大的限制。
[0005] 化i-化η Xie课题组采用新型的click无铜催化，改用叠氮修饰胆碱，并用其与细 胞共培育，用无铜[3+2]click环加成试剂苯并环辛烘DBC0-巧光素来检测，在无铜的情况下 验证叠氮-胆碱成功的标记在细胞膜上。然而该反应的反应速度相对较慢，因而易在体内被 清除而影响其结合的效率。
[0006] 因此，有必要提供一种对细胞毒性低，且反应快速、高灵敏、高分辨率的胆碱示踪 方法。

【发明内容】

[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种胆碱类似物及其制备方法和应用。此外，本发 明还提供了 一种由染料分子标记的四嗦探针及其制备方法和应用。
[000引本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针之间的偶联反应无需铜 催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响，能够快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上 的胆碱类似物进行定位和示踪。
[0009]第一方面，本发明提供了一种胆碱类似物，结构式如P1所示：
[0010]
[ΟΟ?]式中，k为2~4的自然数。
[001 ^ 第二方面，本发明还提供了 一种胆碱类似物的制备方法，包括如下步骤：
[0013] S10、提供如下结构式表示的化合物A和化合物B:
[0014]
[001引在催化剂存在的条件下，将所述化合物A和化合物B按1:1~1.5的摩尔比溶于第一 有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20~30°C下反应0.5~1小时后，经萃取、干燥、硅胶 柱层析分离纯化得到化合物C，其结构式如C所示：
[0017] S20、提供如下结构式表示的化合物D:
[0016] .，：
[001 引
[0019] 式中，k为2~4的自然数，
[0020] 在催化剂存在的条件下，将所述化合物C和化合物D按1:2~5的摩尔比溶于第二有 机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20~30°C下反应0.5~1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱 层析分离纯化得到化合物E，其结构式如E所示：
[0021]
[0022] 式中，k为2~4的自然数，
[0023] S30、将所述化合物E和二甲基乙醇胺按1:1~3的摩尔比溶于第Ξ有机溶剂中，得 到反应液，所述反应液在回流状态下反应12~16小时后，经浓缩、硅胶柱层析分离纯化得到 化合物P1，其结构式如P1所示：
[0024]
[0025] 式中，k为2~4的自然数。
[00%]需要说明的是，本发明设及的结构式中的
为正电荷的符号。
[0027] 优选地，所述步骤S10中，所述催化剂为化晚。
[0028] 优选地，所述步骤S10中，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物A的2~4倍。
[0029] 优选地，所述步骤S10中，所述萃取的方式为在反应结束后的反应液中加入饱和氯 化锭溶液进行萃取。
[0030] 优选地，所述步骤S10中，所述干燥的方式为将萃取所得有机相用无水硫酸钢干 燥，蒸干。
[0031] 优选地，所述步骤S10中，所述第一有机溶剂为二氯甲烧、四氨巧喃、氯仿或N，N-二 甲基甲酯胺。
[0032] 优选地，所述步骤S20中，所述催化剂为Ξ乙胺或N，N-二异丙基乙胺。
[0033] 优选地，所述步骤S20中，所述催化剂的摩尔浓度为所述化合物C的2~5倍。
[0034] 优选地，所述步骤S20中，所述纯化的方式为将反应结束后的反应液浓缩后加入二 氯甲烧进行稀释，并用NaO田容液及水溶液洗涂。
[0035] 优选地，所述步骤S20中，所述干燥的方式为将萃取所得有机相用无水硫酸钢干 燥，蒸干。
[0036] 优选地，所述步骤S20中，所述第二有机溶剂为N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亚讽或 四氨巧喃。
[0037] 优选地，所述步骤S30中，所述第Ξ有机溶剂为N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亚讽或 四氨巧喃。
[0038] 本发明提供的胆碱类似物的合成方法，W非铜催化的双締体（13,85，化）-双环 [6.1.0]壬-4-烘基-9-基甲醇(BCN)为起始化合物，通过对其末端径基的活化，与漠胺类进 行反应得到漠代中间体，并最终与二甲基乙醇胺反应生成胆碱类似物。该方法操作简便、反 应条件溫和、重现性好。
[0039] 该方法的优选步骤包括：1)BCN的活化(BCN-pNC):用对硝基苯基氯甲酸醋(pNC)在 化晚及二氯甲烧的条件下对BCN进行活化;2)中间体BCN-Br的合成：活化后的BCN-pnc与2- 漠乙胺在Ξ乙胺的作用下生成中间体漠代BCN-化；3) BCN修饰的胆碱类似物合成（BCN- 化0):BCN-化与二甲基乙醇胺在四氨巧喃(TW)回流得到目标化合物BCN-化0。
[0040] 本发明提供的化合物A为双締体（IR，8S，化)-双环[6.1. ο]壬-4-烘基-9-基甲醇 (BCN)，化合物Β为对硝基苯基氯甲酸醋(pNC)，化合物C为BCN-pNC，化合物D为漠胺类，化合 物E为BCN-Br。
[0041] 优选地，所述漠胺类为2-漠乙胺或3-漠丙胺。
[0042] 第Ξ方面，本发明提供了一种由染料分子标记的四嗦探针，包括染料分子和四嗦 分子，所述染料分子与四嗦分子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗦分子通过所述共 价键相连，所述染料分子为巧光染料分子或近红外染料分子，所述四嗦分子的结构式如P2 所示：
[0043]
[0044] 其中，町为
[0045] R2为昭！
申，X为CH或N。
[0046] 优选地，所述巧光染料分子为罗丹明、异硫氯酸巧光素、邻苯二甲醒、二甲氨基糞 横酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚胺基甲酸醋或N-9-巧甲氧基碳酷- 氨基酸基-N-簇酸酢。
[0047] 本发明采用的巧光染料分子优选为但不限于所述罗丹明、异硫氯酸巧光素、邻苯 二甲醒、二甲氨基糞横酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚胺基甲酸醋或 N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0048] 在本发明采用的巧光染料分子中，所述异硫氯酸巧光素为氯酸醋类巧光染料、所 述邻苯二甲醒为芳香邻二醒类巧光染料、所述二甲氨基糞横酷氯为酷氯类巧光染料、所述 巧甲氧幾酷氯为氯甲酸醋类巧光染料质、所述6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚胺基甲酸醋 为碳酸醋类巧光染料、所述N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢为酸酢类巧光染料，所 述氯酸醋类、芳香邻二醒类、酷氯类、氯甲酸醋类、碳酸醋类或酸酢类巧光染料具有能与蛋 白质的氨基反应的活性基团，能对蛋白质进行巧光标记;而本发明提供的四嗦分子含有可 供反应的氨基，采用所述巧光染料分子标记所述四嗦分子时，巧光染料分子的活性基团与 所述四嗦分子的氨基反应形成共价键，从而得到所述由染料分子标记的四嗦探针。
[0049] 优选地，当所述巧光染料分子为异硫氯酸巧光素(FITC，结构式如Μ所示）时，所述 共价键为四嗦分子的自由氨基经碳酷氨化而形成的硫碳氨基键。
[(Κ)加]
[0051]优选地，当所述巧光染料分子为罗丹明（结构式如Ν所示），所述共价键为四嗦分子 的自由氨基经脱水缩合而形成的酷胺键，
[0化2]
[0053] 优选地，所述近红外染料分子为吗I噪菁染料分子或者二氨化吩分子。
[0054] 进一步优选地，所述吗I噪菁染料分子的结构式如L所示：
[0化5]
[0化6] 其中，X为C1、化、I或C1化，Υ为0、N、S或CH(C曲)2，R1为烷基或芳香基，R2为烷基或芳 香基，R3为Η、CH3、S〇3一或C 出0，R4为Η、CH3、S〇3一或邸3〇，η为0、1 或2。
[0057]更进一步优选地，所述吗I噪菁染料分子为Cy3或Cy5.5。
[005引具体地，所述Cy3和Cy5.5的结构式如下所示：
[0化9]
[0060]本发明采用的近红外染料分子优选为但不限于所述吗I噪菁染料分子。
[0061 ]第四方面，本发明提供了一种由染料分子标记的四嗦探针的制备方法，包括W下 步骤：
[0062] (1)、提供四嗦分子，所述四嗦分子的结构式如P2所示：
[0063]
[0064] 其中，町为
[00化]R2为Η或
中，X为CH或Ν;
[0066] (2 )、提供染料分子，所述染料分子为巧光染料分子或近红外染料分子.
[0067] (3)、将所述染料分子标记在所述四嗦分子的氨基上，得到由染料分子标记的四嗦 探针，所述由染料分子标记的四嗦探针包括染料分子和四嗦分子，所述染料分子与四嗦分 子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗦分子通过所述共价键相连。
[0068] 优选地，所述步骤(2)中，所述巧光染料分子为罗丹明、异硫氯酸巧光素、邻苯二甲 醒、二甲氨基糞横酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-Ν-径基班巧酷亚胺基甲酸醋或Ν-9- 巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0069] 本发明采用的巧光染料分子优选为但不限于所述罗丹明、异硫氯酸巧光素、邻苯 二甲醒、二甲氨基糞横酷氯、巧甲氧幾酷氯、6-氨基哇嘟基-N-径基班巧酷亚胺基甲酸醋或 N-9-巧甲氧基碳酷-氨基酸基-N-簇酸酢。
[0070] 优选地，所述步骤(2)中，所述近红外染料分子为吗I噪类菁染料分子。
[0071] 进一步优选地，所述吗I噪菁染料分子的结构式如L所示：
[0072]
[007引其中，X为C1、化、I或C1化，Y为0、N、S或CH(C曲)2，R1为烷基或芳香基，R2为烷基或芳 香基，R3为Η、C出、S03一或C出0，R4为Η、C出、S03一或C出0，η为0、1或2。
[0074] 更进一步优选地，所述嘲噪菁染料分子为Cy3或Cy5。
[0075] 本发明采用的近红外染料分子优选为但不限于所述吗I噪菁染料分子。
[0076] 优选地，所述步骤(3)中，当所述巧光染料分子为异硫氯酸巧光素(FITC，结构式如 Μ所示)时，所述共价键为四嗦分子的自由氨基经碳酷氨化而形成的硫碳氨基键。
[0077]
[0078] 优选地，所述步骤(3)中，当所述巧光染料分子为罗丹明（结构式如Ν所示），所述共 价键为四嗦分子的自由氨基经脱水缩合而形成的酷胺键，
[0079]
[0080] 优选地，所述步骤(3)中，所述将染料分子标记在四嗦分子的氨基上，得到由染料 分子标记的四嗦探针的操作为：
[0081] 在Ν，Ν-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基化晚存在的条件下，将染料分子与化合物 Ρ2按1:1~1.5的摩尔比溶于有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20~30°C下反应0.5~ 1小时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到所述由染料分子标记的四嗦探针;其中， 所述N，N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基化晚的摩尔浓度分别为所述染料分子的0.9~ 2.5倍和0.1~0.5倍。
[0082] 进一步优选地，所述染料分子为罗丹明，所述罗丹明的结构式如N所示：
[0083]
,
[0084] 进一步优选地，所述由染料分子标记的四嗦探针的结构式如P3所示；
[0085] P
[0086] 在此优选条件下，本发明采用4-[l，2,4,5]四嗦-3-基-节胺(Tz)对罗丹明B(Rb)进 行标记:Τζ和Rb在缩合剂N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲胺基化晚(DMAP)的 作用下缩合，生成四嗦-罗丹明（Tz-Rb)nTz为非铜催化的亲双締体，能够与双締体BCN在常 溫下发生快速的偶联反应，从而能够快速检验细胞膜上是否含有BCN-化0。
[0087] 本发明第四方面提供的制备方法采用非铜催化的配体基团（1R，8S，9r)-双环 [6.1.0]壬-4-烘基-9-基甲醇(BCN)修饰胆碱，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响； 四嗦基团与BCN的非铜催化click化学的高效反应速率使得胆碱的标记有更高的灵敏度和 分辨率。
[0088] 本发明提供的胆碱类似物在细胞内能通过胆碱激酶的憐酸化作用形成含有胆碱 类似物的憐脂，该憐脂通过一系列细胞内的代谢作用整合到细胞膜上，从而对细胞进行原 位标记。然后采用本发明提供的由染料分子标记的四嗦探针与所述结合在细胞膜表面上的 胆碱类似物发生非铜催化click化学反应，再通过检测所述四嗦探针上的染料分子，即可对 细胞膜表面的胆碱类似物进行示踪。
[0089] 本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针之间的偶联反应在常溫、 生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；其 次，通过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进 行定位和示踪。
[0090] 第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的胆碱类似物或第Ξ方面所述的胆 碱类似物的制备方法在制备细胞原位检测试剂盒中的应用。
[0091] 第六方面，本发明提供了一种如第二方面所述的由染料分子标记的四嗦探针或第 四方面所述的由染料分子标记的四嗦探针的制备方法在制备细胞原位检测试剂盒中的应 用。
[0092] 第屯方面，本发明提供了一种细胞原位检测化合物，所述细胞原位检测化合物为 如第一方面所述的胆碱类似物和如第二方面所述的由染料分子标记的四嗦探针进行偶联 反应后得到的化合物。
[0093] 进一步优选地，所述化合物的结构式如P4所示：
[0094]
[0095] 式中，k为2~4的自然数。
[0096] 本发明提供的胆碱类似物及其制备方法和应用、由染料分子标记的四嗦探针及其 制备方法和应用具有如下有益效果：
[0097] 1)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针之间的偶联反应在常 溫、生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响；
[0098] 2)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针之间的偶联反应后，通 过检测所述标记的染料分子可快速、高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位 和不踪；
[0099] 3)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针的制备方法简单易行， 可W进行大规模生产，且生产成本低；
[0100] 4)本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针可用于制备细胞原位 检测试剂盒。
【附图说明】
[0101] 图1为本发明实施例1~3提供的胆碱类似物的制备流程图；
[0102] 图2为本发明实施例1提供的胆碱类似物的质谱图；
[0103] 图3为本发明实施例4~6提供的由染料分子标记的四嗦探针的制备流程图；
[0104] 图4为本发明实施例4提供的样品的巧光光谱图。
【具体实施方式】
[0105] W下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0106] 图1为本发明提供的一种胆碱类似物的制备流程图，结合图1，本发明提供了实施 例1~3如下：
[0107] 实施例1
[01 ο引一种胆碱类似物(BCN-化ο)的合成，包括如下步骤：
[0109] 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0110] 在100血无水二氯甲烧中溶解5mmo 1的BCN，其中加入1 Ommo 1的化晚，揽拌数分钟后 加入对5mmol的对硝基苯基氯甲酸醋（pNC)，20°C下反应30min，结束后加入饱和氯化锭溶 液，萃取，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC(产 率为70%);
[0111] 2)中间体BCN-Br的合成
[0112] 将4.4mmo 1的BCN-pNC溶解在1 OmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入1 Ommo 1的2- 漠乙胺盐酸盐和lOmmol的Ξ乙胺，在20°C下反应30min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲 烧，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯 化，得到白色固体BCN-Br (产率为70 % );
[0113] 3)BCN修饰的胆碱类似物合成(BCN-化0)
[0114] 将5mmol的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入lOmmol的二甲基乙醇胺， 充分揽拌后，回流状态下反应12小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN- Ch〇(产率为60%)。
[0115] 对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z):309.2160(M+)。为充分说明本发明 的有益效果，本实施例还提供了BCN-化o的质谱图，如图3所示。
[0116] 实施例2
[0117] -种胆碱类似物(BCN-化0)的合成，包括如下步骤：
[011 引 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0119] 在100血无水二氯甲烧中溶解5mmo 1的BCN，其中加入15mmo 1的化晚，揽拌数分钟后 加入对6mmol的对硝基苯基氯甲酸醋（pNC)，25°C下反应40min，结束后加入饱和氯化锭溶 液，萃取，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC(产 率为74%);
[0120] 2)中间体BCN-Br的合成
[01別]将4.4mmol的BCN-pNC溶解在lOmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入20mmol的3- 漠丙胺盐酸盐和15mmol的Ξ乙胺，在25°C下反应40min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲 烧，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯 化，得到白色固体BCN-Br (产率为78 % );
[0122] 3) BCN修饰的胆碱类似物合成(BCN-化0)
[0123] 将5mmo 1的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入15mmo 1的二甲基乙醇胺， 充分揽拌后，回流状态下反应14小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN- Ch〇(产率为70%)。
[0124] 对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z) :323.2327(M+)。
[0125] 实施例3
[01 %] -种胆碱类似物(BCN-化ο)的合成，包括如下步骤：
[0127] 1)BCN 的活化(BCN-pNC)
[0128] 在100血无水二氯甲烧中溶解5mmol的BCN，其中加入20mmol的化晚，揽拌数分钟后 加入对7.5mmol的对硝基苯基氯甲酸醋(pNC)，30°C下反应60min，结束后加入饱和氯化锭溶 液，萃取，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC(产 率为69%);
[0129] 2)中间体BCN-Br的合成
[0130] 将4.4mmo 1的BCN-pNC溶解在1 OmL的N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中，加入15mmo 1的4- 漠下胺盐酸盐和20mmol的Ξ乙胺，在30°C下反应60min。混合物浓缩后加入一定量二氯甲 烧，并用1N的化0田容液及水溶液洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯 化，得到白色固体BCN-Br (产率为80 % );
[0131] 3)BCN修饰的胆碱类似物合成(BCN-化0)
[0132] 将5mmo 1的BCN-化溶解在20mL的四氨巧喃（THF)中，加入1 Ommo 1的二甲基乙醇胺， 充分揽拌后，回流状态下反应16小时。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体BCN- Ch〇(产率为75%)。
[0133] 对BCN-Cho进行质谱检测，得到质谱(MS m/z):337.2607(M+)。
[0134] 图3为本发明提供的一种由染料分子标记的四嗦探针的制备流程图；结合图3,本 发明提供实施例4~6如下：
[0135] 实施例4
[0136] -种由染料分子标记的四嗦探针的制备方法，包括W下步骤：
[0137] 将5mmo 1的罗丹明Rb溶解5mL的DMF当中，加入4.5mmo 1的N，N-二环己基碳二亚胺 (DCC)，0.5mmol的4-二甲胺基化晚(DMAP)和5mmol四嗦（Tz)，20°C下揽拌反应12个小时，反 应结束后加入二氯甲烧，用饱和食盐水洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，浓缩，硅胶柱层析 分离纯化得到红色粉末Τζ-肺(产率为75% )。
[0138] 对Τζ-肺进行质谱检测，得到质谱(MS m/z):613.3159(M+)。
[0139] 实施例5
[0140] -种由染料分子标记的四嗦探针的制备方法，包括W下步骤：
[0141 ] 将5mmol的罗丹明Rb溶解一定量的DMF当中，加入7.5mmol的Ν,Ν-二环己基碳二亚 胺化CC)，0.25mmo 1的4-二甲胺基化晚(DMAP)和7mmo 1四嗦(Τζ)，25 °C下揽拌反应14个小时， 反应结束后加入二氯甲烧，用饱和食盐水洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，浓缩，硅胶柱层 析分离纯化得到红色粉末Τζ-肺(产率为80%)，并采用薄层层析(TLC)对照分析本实施例制 备的Tz-Rb。
[0142] 实施例6
[0143] -种由染料分子标记的四嗦探针的制备方法，包括W下步骤：
[0144] 将5mmol的罗丹明（肺)溶解一定量的DMF当中，加入12.5mmol的Ν,Ν-二环己基碳二 亚胺(DCC)，0.25mmol的4-二甲胺基化晚（DMAP)和7.5mmol四嗦（Tz)，30°C下揽拌反应16个 小时，反应结束后加入二氯甲烧，用饱和食盐水洗涂，有机相用无水硫酸钢干燥，浓缩，硅胶 柱层析分离纯化得到红色粉末Τζ-肺(产率为85%)，并采用薄层层析(TLC)对照分析本实施 例制备的Tz-Rb。
[0145] 实施例7
[0146] 为充分说明本发明的有益效果，本实施例采用实施例1制备的胆碱类似物BCN-化0 与实施例4制备的由染料分子标记的四嗦探针Tz-Rb进行反应，反应方程式如下：
[0147]
[0148] 为充分说明本发明的有益效果，本实施例还提供了所述BCN-化ο与所述Tz-Rb进行 反应后所得产物的巧光光谱分析，作为对照，同时还对所述Tz-Rb进行了巧光光谱分析，结 果如图4所示，其中，曲线1为实施例1制备的胆碱类似物Tz-Rb的巧光光谱，曲线2为所述 BCN-Cho与所述Tz-Rb进行反应后所得产物的巧光光谱。有图4可知，曲线1的巧光强度低于 曲线2，即所述Tz-Rb的四嗦环与BCN-cho反应后提高了 Tz-Rb的巧光强度。
[0149] 本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探针之间的偶联反应在常溫、 生理环境中就能快速发生，且无需铜催化，避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响。
[0150] W上结果充分说明了采用本发明提供的胆碱类似物与由染料分子标记的四嗦探 针能在无铜催化的条件下快速发生偶联反应，能用于对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和 示踪，具有低毒、快速、高灵敏、高分辨率的优点。
[0151] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种由染料分子标记的四嗪探针，其特征在于，包括染料分子和四嗪分子，所述染料 分子与四嗪分子的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗪分子通过所述共价键相连，所述 染料分子为焚光染料分子或近红外染料分子，所述四嗪分子的结构式如P2所不：2. 如权利要求1所述的由染料分子标记的四嗪探针，其特征在于， 所述荧光染料分子为罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴甲 氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐;所述近红外染料分子为吲哚菁染料分子或者二氢卟吩分子。3. -种由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1 )、提供四嗪分子，所述四嗪分子的结构式如P2所示：(2 )、提供染料分子，所述染料分子为荧光染料分子或近红外染料分子； (3)、将所述染料分子标记在所述四嗪分子的氨基上，得到由染料分子标记的四嗪探 针，所述由染料分子标记的四嗪探针包括染料分子和四嗪分子，所述染料分子与四嗪分子 的氨基形成共价键，所述染料分子与四嗪分子通过所述共价键相连。4. 如权利要求3所述的由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，其特征在于，所述步骤 (2)中，所述荧光染料分子为罗丹明、异硫氰酸荧光素、邻苯二甲醛、二甲氨基萘磺酰氯、芴 甲氧羰酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯或N-9-芴甲氧基碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐;所述近红外染料分子为吲哚菁染料分子。5. -种如权利要求3所述的由染料分子标记的四嗪探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤(3)中将所述染料分子标记在四嗪分子的氨基上，得到由染料分子标记的四嗪探针的 操作为： 在N，N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶存在的条件下，将染料分子与化合物P2按 1:1~1.5的摩尔比溶于有机溶剂中，得到反应液，所述反应液在20~30°C下反应0.5~1小 时后，经萃取、干燥、硅胶柱层析分离纯化得到所述由染料分子标记的四嗪探针;其中，所述 N，N-二环己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶的摩尔浓度分别为所述染料分子的0.9~2.5倍 和0.1~0.5倍。6. 如权利要求1所述的由染料分子标记的四嗪探针在制备细胞原位检测试剂盒中的应 用。7. -种细胞原位检测化合物，其特征在于，所述细胞原位检测化合物为一种胆碱类似 物和如权利要求1所述的由染料分子标记的四嗪探针进行偶联反应后得到的化合物，其中， 所述胆碱类似物的结构式如Pl所示：
【文档编号】G01N21/64GK106010507SQ201610348541
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2013年12月31日
【发明人】蔡林涛, 李文军, 潘正银, 张鹏飞, 刘宏
【申请人】深圳先进技术研究院