专利名称：一株邻苯二甲酸酯类高效降解菌分离及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一株用富集培养的方法从活性污泥中自行分离得到并能高效降解邻苯二甲酸酯类环境激素的菌株(Gordonia sp. QH-9)及其应用。
背景技术：
邻苯二甲酸酯(phthalate acid esters，PAEs)类化合物又称酞酸酯类，一般为无色透明油状液体，难溶于水且不易挥发，凝固点低，易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂，主要应用于塑料制品，用来提高可塑性和韧性，还用作农药、燃料、化妆品、香料和医疗器材的生产原料。PAEs类化合物是大约30种化合物的总称，由邻苯二甲酸和相应的醇化合而成， 应用最多的是酞酸二异辛酯(DEHP)，其次是邻苯二甲酸二丁酯G)BP)。我国常用的品种有 邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)等。近年来，由于PAh类化合物的大量生产与广泛应用，在大气、土壤、生物体乃至人体都发现PAhK合物的存在。PAh类化合物具有雌激素样作用，能够干扰人体内正常的内分泌从而影响生殖，因而被称为环境激素；也发现该类化合物具有致癌、致畸、致突变和致哮喘的作用。PAh类化合物随着烟尘、废弃物、工业和生活垃圾、废水等大量地进入我们生存的环境中，威胁人类的健康。由于邻苯二甲酸酯类化合物在自然界中光解和水解速率很慢，微生物降解是其矿化的主要途径。筛选高效降解菌具有重要的实践意义。邻苯二甲酸酯降解微生物筛选常用的方法是从邻苯二甲酸酯类污染地区采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。城市污水处理厂的处理水来源复杂，有机污染物程度较高。其中，邻苯二甲酸酯是生活污水中的重要污染物之一。活性污泥法处理污水时，有机污染物的去除主要是通过活性污泥中的微生物降解，从而达到污水净化的目的。然而，随着塑料工业的发展，邻苯二甲酸酯的污染也不断加剧，在污水处理厂的出水口也可以检测到邻苯二甲酸酯类化合物的存在，因此，从污水处理厂采集活性污泥，通过富集培养，梯度压力法驯化，获得高效降解菌并应用于实践，对于降低邻苯二甲酸酯在环境中的危害具有现实意义。本专利是从A2/0工艺运行的污水处理厂曝气池采集的活性污泥中分离出的一株高效降解邻苯二甲酸丁酯的菌株，命名为Gordonia sp. QH-9，实验表明该菌能利用邻苯二甲酸二丁酯作为唯一碳源和能源生长繁殖，在纯培养条件下，该菌1 能将无机盐培养基中500mg/LDBP降解完全，且在宽pH范围内均能较好的降解DBP ；另外，该菌能在Cr浓度范围为5-30mg/L存在条件下，也有较强的环境适应能力，在IMi能将500mg/L的DBP降解 13% -50%。该菌同时对邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二己酯，邻苯二甲酸正辛酯和邻苯二甲酸异辛酯等均具有良好的利用能力。充分说明该菌可用于废水的生物处理及邻苯二甲酸污染土壤的生物修复。
发明内容
本发明的目的是提供一株从活性污泥中自行分离得到的能够高效降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株，并提供该菌剂的生产方法。本发明所提供的降解邻苯二甲酸酯类化合物的菌株是由我们从北京市清河污水处理厂曝气池取的活性污泥样品富集培养得到的。这是一株具有极高活力，对邻苯二甲酸脂类降解能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变 异，可以直接用于废水处理。将其编号为QH-9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年12月30日，分类命名为Gordonia sp. QH-9。保藏编号为CGMCC No. 4422。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了 GenBank数据库。在http //www. ncbi. nlm. nih. gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与 Gordonia sp.相似性最高，可以达到99%以上。本发明所述的菌剂的生产方法如下1、培养基配制1)菌种保藏培养基(固体，1L)胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g， 加水至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；2)菌种活化培养基(液体，1L)胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ；3)种子培养基(液体，1L) :K2HP044. 8g，ΚΗ2Ρ043· 5g，(NH4) 2S042g，MgCl2O. 16g， CaCl2O. 02g, Na2MoO4. 2H20 0. 0024g, FeCl3O. 0018g, MnCl2. 2H20 0. 0015g，pH = 7. O。以上培养基均在121°C灭菌15-30min。2、菌种活化挑取邻苯二甲酸酯降解菌至菌种保藏培养基，30°C连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30°C，150-200r/min摇床振荡培养 12-24h ；3、液体种子制备向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照10%的接种量接种邻苯二甲酸酯降解菌，于25-38°C，通空气培养16-24h，得到液体种子。4、液态发酵向装有高温灭菌的种子培养基中，接种邻苯二甲酸酯降解菌，于 25-38 0C，通空气培养16-48h，得到活菌体培养物。5、菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至101(lCell/mL，加入甘油(体积分数50% )，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。由本发明技术方案生产的邻苯二甲酸酯降解菌剂能够有效降解环境中的邻苯二甲酸酯类化合物。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
具体实施例方式实施例1 邻苯二甲酸酯降解菌剂对摇瓶中邻苯二甲酸二丁酯的降解效果1)在100ml含有500mg/L邻苯二甲酸二丁酯的无机盐培养基中接种2ml的菌液； 不接种的作为对照组2) 16h后，取样萃取，利用HPLC测定邻苯二甲酸二丁酯的含量，发现处理组检测不到邻苯二甲酸二丁酯的存在，而对照组几乎无降解。
本发明所提供的降解邻苯二甲酸脂的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年12月30日，分类命名为Gordonia sp. QH-9。保藏编号为CGMCC No. 4422。
权利要求
1.一株能够高效降解邻苯二甲酸脂的细菌菌株，该菌株命名为Gordonia sp.QH_9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4522。
2.权利要求1所述的Gordoniasp. QH-9，其特征在于菌落透明，表面平滑，不反光， 边缘光滑。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了 GenBank数据库，发现该序列与 Gordonia sp.菌株基因序列高度同源。
3.权利要求书1所述该菌株Gordoniasp. QH-9的培养方法，其特征是将该菌菌体接到斜面上，在30°C下，斜面培养基上生长1-2天，挑取菌体在30°C下，培养液中培养2-3天，经离心可以获得该菌株的纯细胞。所述的培养基组成为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g加水至1L，pH 7.0,液体培养基不加琼脂。
4.权利要求书1所述菌株Gordoniasp. QH-9的用途，其特征是能使多种邻苯二甲酸酯降解，其降解培养基(液体，1L) :K2HP044. 8g, KH2P043. 5g, (NH4)2SOJg，MgCl2O. 16g， CaCl2O. 02g, Na2MoO4. 2H20 0. 0024g, FeCl3O. 0018g, MnCl2. 2H20 0. 0015g, pH = 7. O。
5.权利要求书4所述的用途，其特征是以该菌为菌种，以邻苯二甲酸酯为碳源，降解邻苯二甲酸酯。
全文摘要
本发明涉及一株分离自活性污泥的能够高效降解邻苯二甲酸酯的菌株，以及利用该菌株对邻苯二甲酸酯进行降解的方法，属于生物技术领域。经鉴定这株菌为Gordonia属，命名为Gordonia sp.QH-9，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4522，将该菌株序列在Genbank中BLAST检索比对，发现该序列与Gordoniasp.菌株基因序列高度同源。它在以邻苯二甲酸二丁酯为唯一碳源的培养基和培养液中生长良好，它对其他邻苯二甲酸酯均具有良好的降解效果。由本发明技术方案生产的降解菌剂能高效降解环境中的邻苯二甲酸酯，保护生态环境。
文档编号C02F3/34GK102154173SQ201110007548
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者余志晟, 张洪勋, 杨敏, 王萍, 白志辉, 金德才, 齐嵘 申请人:中国科学院生态环境研究中心, 中国科学院研究生院