用于检测辅酶q10的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了易于适应于高通量筛选方法的用于快速和定量提取和检测样品中辅酶Q10的方法。本发明还提供了用于实施本发明的方法的试剂和试剂盒。
【专利说明】用于检测辅酶Q10的方法和试剂盒
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年3月2日提交的61/606019号美国临时申请的优先权，其全部 内容在此通过引用并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 辅酶Q10,本文也称为CoQlO、泛醌或泛癸利酮，是一种常用的营养补充物，并可以 作为维生素类补充剂在营养品商店、健康食品商店、药店等处找到其胶囊的形式，以通过泛 醇（CoQlO的还原形式）的抗氧化性能帮助保护免疫系统。CoQlO在人体的大部分组织和其 他哺乳动物的组织中普遍发现。CoQlO是高度亲脂性的，并且在大部分不溶于水。不溶性与 烃性质的50个碳原子的类异戊二烯侧链有关，如CoQlO的如下结构中所示。
[0005]
【权利要求】
1. 一种用于测定样品中辅酶QlO(CoQlO)的量的方法，所述方法包括： 向所述样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离；和 光谱学地分析所述第二提取层来测定CoQlO的量。
2. -种用于测定样品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述样品中加入第一提取缓冲液和第二提取缓冲液； 混合所述样品；和 分析所述第二提取层以测定CoQlO的量，其中所述第一提取缓冲液和第二提取缓冲液 的单次提取导致比使用单独甲醇的提取检测到至少2倍的CoQlO量。
3. -种用于测定样品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述样品中加入第一提取缓冲液； 加热并混合所述样品； 向所述样品中加入第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离； 加热并混合所述样品； 冷却所述样品至环境温度；及 分析所述第二提取缓冲液层以测定样品中CoQlO的量。
4. 一种用于测定样品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： 向所述样品中加入第一提取缓冲液； 加热并混合所述样品； 向所述样品中加入第二提取缓冲液，其导致所述样品的相分离； 加热并混合所述样品； 冷却所述样品至环境温度；及 通过光谱分析对第二提取缓冲液层进行光谱学分析，以测定样品中CoQlO的量，其中 用提取缓冲液的单次提取导致比使用单独甲醇提取随后是液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/ MS)提取到至少2倍的CoQlO量。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在样品中检测到的CoQlO的量是通过 光谱分析法光谱学地测定的。
6. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中CoQlO的量用LC/MS/MS检测。
7. 如权利要求2或4中任一项所述的方法，其中所述使用第一提取缓冲液和第二提取 缓冲液提取的CoQlO的量光谱学地测定，和用单独甲醇提取检测的CoQlO的量使用LC/MS/ MS测定。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量筛选分析方法的部 分。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法通过自动化完成。 1 〇.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在短的时间段中完成。
11. 如权利要求1、3-4和7-10中任一项所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后 LC/MS/MS的CoQlO检测而检测到的CoQlO的总量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第 二提取缓冲液提取并且CoQlO的量光谱学地测定，在样品中检测到的CoQlO的总量至少为 2倍。
12. 如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQlO检测 而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQlO的量 光谱学地测定，在样品中检测到的CoQlO的总量为至少5倍。
13. 如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQlO检测 而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQlO的量 光谱学地测定，在样品中检测到的CoQlO的总量为至少10倍。
14. 如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQlO检测 而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQlO的量 光谱学地测定，在样品中检测到的CoQlO的总量为至少15倍。
15. 如权利要求11所述的方法，其中与使用单独甲醇提取随后LC/MS/MS的CoQlO检测 而检测到的量相比，所述样品使用第一提取缓冲液和第二提取缓冲液提取并且CoQlO的量 光谱学地测定，在样品中检测到的CoQlO的总量为至少25倍。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含非极性溶 剂。
17. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含有机溶剂。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含选自于苯、 甲苯、二甲苯、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、1，4-二氧六烷、氯仿、二乙醚、二异丙醚和二异丁基 醚、四氯化碳、二甲基甲酰胺（DMF)、氯甲烷和二氯甲烷的溶剂。
19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含烷烃。
20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含己烷。
21. 根据权利要求1-15和17中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含乙 腈。
22. 根据权利要求1-15和17中任一项所述的方法，其中所述第二提取缓冲液包含异丙 醇。
23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含极性质子 溶剂。
24. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含有机溶剂。
25. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含选自于甲 酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸（TCA)和水的溶剂。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述溶剂包含醇。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述醇是甲醇。
28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含表面活性 剂。
29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含去垢剂。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述去垢剂是温和的去垢剂。
31. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液是水性溶液。
32. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液包含类固醇酸。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述类固醇酸是胆汁酸。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述胆汁酸包含选自于牛黄胆酸、甘氨胆酸、胆 酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸的酸。
35. 如权利要求33所述的方法，其中所述胆汁酸包含脱氧胆酸。
36. 如权利要求35所述的方法，其中脱氧胆酸是盐。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐包含的无机离子是I族金属。
38. 如权利要求37所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐的无机离子包含作为选自于Li+、 Na+和K+的盐的无机离子。
39. 如权利要求34所述的方法，其中所述脱氧胆酸盐的无机离子包含作为钠离子的无 机离子。
40. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含生物样品。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述生物样品是基于细胞的样品。
42. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含哺乳动物样品或两栖 动物样品。
43. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含选自于人类样品、非人 灵长类动物样品和啮齿动物样品的样品。
44. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是来自于选自小鼠、大鼠、 豚鼠、兔和人的受试者的样品。
45. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光谱分析通过使用选自于吸收 光谱法、荧光X射线光谱法、火焰光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、红外光谱法、近红外光 谱法、拉曼光谱法、相干反斯托克斯拉曼光谱法（CARS)、核磁共振光谱法、光子发射光谱法 和穆斯堡尔光谱法的光谱技术进行。
46. 如权利要求45所述的方法，其中所述光谱技术是紫外光谱法。
47. 如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱法在270nm至280nm的一个或 多个波长处进行。
48. 如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱法在273nm至277nm的一个或 多个波长处进行。
49. 如权利要求45或46所述的方法，其中所述紫外光谱在275nm的波长处进行。
50. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一提取缓冲液的体积与所述 第二提取缓冲液的体积之比是5:1至1:1。
51. 如权利要求28至50中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂或去垢剂与所述第 一提取缓冲液的体积之比为50:1至1:1。
52. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至50-100°C。
53. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至55-75°C。
54. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至60-70°C。
55. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液、第二提取缓冲液或第一和第二提取缓冲液两者后加热至65°C。
56. 如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液和所述第二提取缓冲液后加热至相同的温度。
57. 如权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液和所述第二提取缓冲液后加热至不同的温度。
58. 如权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述的加热持续至少5秒、至少10 秒、至少15秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少75秒、至少 90秒、至少105秒或至少120秒的时间。
59. 如权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液和所述第二提取缓冲液后加热相同的时间量。
60. 如权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述样品在添加所述第一提取缓冲 液和所述第二提取缓冲液后加热不同的时间量。
61. 如权利要求52至60中任一项所述的方法，其中与没有被加热的对照样品相比，力口 热样品提高CoQlO的提取至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30% 或至少50%。
62. 如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过机械搅拌混合。
63. 如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过超声处理混合。
64. 如权利要求2-61中任一项所述的方法，其中所述样品通过磁力搅拌混合。
65. 如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第一提取缓冲 液后混合。
66. 如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第二提取缓冲 液后混合。
67. 如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述样品在加入所述第一提取缓冲 液和所述第二提取缓冲液后混合。
68. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在加入所述第二提取缓冲液后向所 述样品中加入无机盐。
69. 如权利要求68的方法，其中所述无机盐包括NaCl。
70. 根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中在加入所述第二提取缓冲液后，向 所述样品中添加饱和盐水溶液。
71. 如权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述盐被添加至约ImM至约50mM 的终浓度。
72. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第二提取缓冲液的光谱分析 前过滤所述样品。
73. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在10分钟内完成。
74. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在5分钟内完成。
75. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在1分钟内完成。
76. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中整个方法在30秒内完成。
77. -种用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒。
78. 如权利要求77所述的试剂盒，包含如下的至少两种：第一提取缓冲液、第二次提取 缓冲液和CoQlO。
79. -种用于测定样品中辅酶QlO(CoQlO)的量的方法，所述方法包括： a)向所述样品中加入已知量的氣化辅酶Q10(CoQ10-d6); b) 通过质谱检测CoQlO和CoQ10-d6 ;和 c) 通过与已知量的检测到的C〇Q10-d6相比较来测定检测到的CoQlO的量。
80. -种用于测定样品中还原形式的C〇Q10(C〇Q10H2)的量的方法，所述方法包括： a) 向所述样品中加入已知量的还原的氣化辅酶Q10(CoQ10H2-d6); b) 通过质谱检测C〇Q10H2和CoQ10H2-d6 ;和 c) 通过与已知量的检测到的C〇Q10H2-d6相比较来测定检测到的C〇Q10H2的量。
81. -种用于同时测定样品中CoQlO和C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6 ; b) 通过质谱检测 CoQlO、C〇Q10H2、CoQ10-d6 和 CoQ10H2-d6 ;和 c) 通过与已知量的检测到的C〇Q10H2-d6相比较来测定检测到的CoQlO的量；和 d) 通过与已知量的检测到的C〇Q10H2-d6相比较来测定检测到的C〇Q10H2的量。
82. -种用于测定样品中C〇Q10H2氧化程度的方法，所述方法包括： a) 向所述样品中加入已知量的CoQ10H2-d6和/或CoQ10-d6 ; b) 通过质谱测量所述样品中C〇Q10H2-d6和C〇Q10-d6的相对量；和 c) 将CoQ10H2-d6和CoQ10-d6的理论相对量与在步骤b中测量的CoQ10H2-d6和 CoQ10-d6的相对量相比较。
83. 如权利要求80-82所述的方法，其中通过将CoQ10-d6与一种或多种还原剂进行反 应而获得CoQ10H2-d6。
84. 如权利要求83所述的方法，其中所述还原剂是硼氢化钠。
85. 如权利要求81-84所述的方法，其中在样品收集后立即将CoQ10-d6和/或 CoQ10H2-d6加入到所述样品中。
86. 如权利要求81-85所述的方法，其中所述样品是生物样品。
87. 如权利要求86所述的方法，其中所述生物样品是血浆或血清。
88. 如权利要求86或87所述的方法，其中所述生物样品是人类样品。
89. -种用于测定样品中CoQlO的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述样品； b) 向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6; c) 提取所述样品； d) 任选地将所述样品进行液相色谱； e) 通过质谱检测CoQlO和CoQ10-d6 ;和 f) 通过与已知量的检测到的C〇Q10-d6相比较来测定检测到的CoQlO的量。
90. -种用于测定样品中C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述样品； b) 向所述样品中加入已知量的CoQ10H2-d6; c) 提取所述样品； d) 任选地将所述样品进行液相色谱； e) 通过质谱检测C〇Q10H2和CoQ10H2-d6 ;和 f) 通过与已知量的检测到的C〇Q10H2-d6相比较来测定检测到的C〇Q10H2的量。
91. 一种用于测定样品中CoQlO和C〇Q10H2的量的方法，所述方法包括： a) 提供所述样品； b) 向所述样品中加入已知量的CoQ10-d6和CoQ10H2-d6 ; c) 提取所述样品； d) 任选地将所述样品进行液相色谱； e) 通过质谱检测 CoQlO、CoQ10-d6、C〇Q10H2 和 CoQ10H2-d6 ; f) 通过与已知量的检测到的C〇Q10-d6相比较来测定检测到的CoQlO的量；和 g) 通过与已知量的检测到的C〇Q10H2-d6相比较来测定检测到的C〇Q10H2的量。
92. 如权利要求89-91所述的方法，其中步骤c包括加入提取缓冲液。
93. 如权利要求92所述的方法，其中所述提取缓冲液包含1-丙醇。
94. 如权利要求92所述的方法，其中所述提取缓冲液包含异丙醇。
95. 如权利要求89-94所述的方法，其中步骤b-d使用预冷的低温模块实施。
【文档编号】C02F3/00GK104245599SQ201380021300
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月2日
【发明者】N·N·坦纳, R·萨兰加拉简, N·R·纳莱恩, S·栾 申请人:博格有限责任公司