一株米根霉菌株jhsw01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废 液和农林废弃物中的应用。
【背景技术】
[0002] 农作物秸杆是地球上第一大可再生资源，我国拥有量居世界首位。全国每年产生 的大约6亿多吨农作物秸杆中，通过机械化还田和堆怄腐熟还田利用农作物秸杆2亿吨左 右，采用青贮、氨化等过腹还田方式利用2亿吨左右，另外还有少量农作物秸杆用于气化和 加工等，秸杆总量的2/3已基本实现了综合利用，还有约1/3、即2亿吨左右剩余秸杆尚未得 到综合利用，一些农民采取了最简单的处理方式-焚烧，造成了大气污染、土壤矿化、火灾 事故等大量的社会经济和生态问题，引起了全社会的广泛关注。
[0003] 秸杆本身主要有纤维素、半纤维素和木质素三种物质组成，还含有少量蛋白质和 矿物元素，是一种良好的微生物生长基质。而米根霉是中国药和酒曲中的重要霉菌之一， 可产生大量的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶，分解秸杆中的纤维素和半纤维素，将其转化为乳酸 等有机酸。但是目前该菌种用于农林废弃物的发酵软化处理的应用较少，因此筛选合适的 菌株并开发出合适的发酵工艺条件可拓宽米根霉在制浆造纸等领域的应用。
【发明内容】
[0004] 针对目前米根霉在农林废弃物处理中应用少、发酵效率慢的状况，本发明的目的 是提供了一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用，所述菌株 JHSWOl没有毒副作用，发酵快，菌体生长营养要求简单，本发明利用筛选到的米根霉菌株 JHSWOl用于发酵农林废弃物，发酵方法简易，具有良好的市场应用前景。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现： 一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废液中的应用，所述米根霉菌株JHSWO1，其分 类命名为其保藏编号为CCTCC M 2015189。
[0006] 进一步的：将米根霉菌株JHSWOl接种到有机废液中，米根霉JHSWOl能将有机废液 中的糖转化成乳酸。
[0007] 进一步的：发酵条件为：接种量为质量比0. 5~5%，pH4~9,温度15°C ~45°C以上，发 酵时间控制在24~96h。
[0008] 本发明还提供了一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，所述 米根霉菌株JHSW01，其分类命名为TSizo/WAs 其保藏编号为CCTCC M 2015189。
[0009] 进一步的：将米根霉菌株JHSWOl固体发酵菌剂按质量比0. 5%~5%加入到农林废弃 物中，控制农林废弃物的湿度为80%-100%进行发酵。
[0010] 进一步的：所述米根霉菌株JHSWOl固体发酵菌剂的制备如下：将米根霉JHSWOl 接种到种子培养基中进行培养获得种子培养液；将所述种子培养液接种到固体培养基中进 行发酵培养，按照质量比干燥农作物秸杆粉末：干燥林业废弃物粉末：氮源=5~8 :2~3 :1~2 将三种组分混合制得固体培养基，将所述种子培养液加水稀释获得种子稀释液，调PH9. 0， 然后将固体培养基和所述种子稀释液混合堆积培养，固体培养发酵条件为：湿度大于80%， 温度20~35°C，pH7~10,发酵48~72小时，当发酵堆表面布满米根霉菌株JHSWOl菌丝体后， 获得米根霉菌株固体发酵菌剂。
[0011] 进一步的：所述米根霉菌株JHSWOl发酵农林废弃物后的产物用于制备微生物肥 料和饲料。
[0012] 进一步的：所述米根霉菌株JHSWOl与枯草芽孢杆菌按照菌体数量2 :1复配用于 发酵农林废弃物制备微生物肥料和饲料。
[0013] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从腐木中筛选到一株米根 霉菌株JHSW01，经实验验证其具有产生高糖化酶活的能力，可以有效的分解纤维素和半纤 维素；本发明菌种固态法生产中耐受高温，在农林废弃物的堆腐发酵过程中具有较长的繁 殖发酵时间；本发明采用的培养基配方简易易于配制，有利于工业生产的成本节省；使用 本发明菌种发酵条件比较宽泛，不需要精细调节，节省人力物力成本。
[0014] 结合本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
【附图说明】
[0015] 图1是米根霉菌株JHSWOl的平板培养图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0017] 实施例1 一、米根霉菌株JHSWOl的分离筛选 2010年7月4日从山东沂南大庄小麦腐烂秸杆中取样50余份，分别取6g样品粉末浸 泡在50 mL生理盐水中，20°C条件下，每2h震荡一次。分别取IOOyL样品悬浮液在营养琼 脂平板均匀涂布，28°C恒温培养箱中培养3~7d，挑取形态典型的单菌落用划线法接种到营 养琼脂平板上，通过反复多次划线得到纯菌，共筛选出8株霉菌。
[0018] 将所得到的8株霉菌用接种环接种到液体PDA培养基中进行培养。获得的其中一 株菌命名为米根霉JHSW01，其符合米根霉菌的生物学特性，具体为：革兰氏染色阳性；菌落 稠密，菌丝匍匐爬行，最初呈白色，后变为黑褐色；假根发达，分枝呈根状，呈黑褐色；孢子 丝上有厚坦孢子，孢囊梗2~4成束，孢囊梗直立有分枝，后呈黑色，参见附图1。
[0019] 二、米根霉菌株JHSTOl的细菌分子遗传学分类鉴定 首先提取菌株JHSWOl的DNA，以该DNA为模板，18S rDNA通用引物为引物，对18S rDNA 片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST 程序进行比对，结果显示该菌株18S rDNA序列与GenBank基因库中根霉菌属中的Rhizopus oryzae的18s rDNA序列同源度最高，同源率达到100%。通过DNAMAN6. 0对Genbank中已 有的芽孢杆菌属的18S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株JHSWOl的18S rDNA 与Rhizopus oryzae同源性最高，因此可以判定该菌株为根霉菌属的米根霉菌。
[0020] 经所述生物学特性鉴定和细菌分子遗传学分类鉴定方法鉴定，可以确定所筛选 到的菌株JHSWOl为根霉属，米根霉菌。将筛选到的米根霉菌株JHSWOl进行菌种保藏，保 藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC);地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保 藏中心；保藏日期：2015年4月2日，米根霉的保藏编号为CCTCC M 2015189。
[0021] 三、米根霉菌株JHSWOl的培养方法 1、 斜面培养：采用PDA斜面培养基对米根霉菌株JHSWOl进行培养； 2、 种子培养：将米根霉接种到种子培养基中进行培养获得种子培养液；种子培养基的 组成为：农林废弃物提取液IL ;添加大豆蛋白胨10~40g，酵母膏10~40g、麦芽糖10~40g，。 调整ρΗ7· 0~8· 0,在10~40°C下进行培养。
[0022] 所述农林废弃物提取液的配制如下：取20g秸杆粉末加入200mL水，调节pH至9， 蒸煮30min，八层纱布过滤，加水至1L。
[0023] 3、发酵培养：将所述种子培养液接种到固体培养基中进行发酵培养，按照质量比 干燥农作物秸杆粉末：干燥林业废弃物粉末：氮源=5~8 :2~3 :1~2将三种组分混合制得固 体培养基，将所述种子培养液加水90~100倍稀释获得种子稀释液，调pH9. 0,然后将所述固 体培养基和所述种子稀释液按照质量比I : 1混合，堆积培养，堆积厚度可在200mm~600mm范 围内，发酵过程保持湿度，pH控制在7~9,待秸杆粉末干重差别大于20%时，发酵完成，发酵 曲自然晾干或吹干后即得发酵剂。
[0024] 固体培养发酵条件为：湿度大于80%，温度20~35°C，pH7~10,发酵48~72小时，当 发酵堆表面布满米根霉菌株JHSWOl菌丝体后，获得米根霉菌株固体发酵菌剂。
[0025] 四、米根霉菌株JHSWOl在发酵过程中产生高糖化酶活的测定 称取麦麸 2. 4g，大豆蛋白胨 I. 6g，可溶性淀粉 0· 8g，K2HPO4O. 16g，MgSO4. 7H20 0· 04g， KCl 0.04g溶于80mL的蒸馏水后，置于250mL三角瓶中，121°C灭菌20min。冷却后接种两 环斜面米根霉JHSWOl菌丝体，置于30°C，190rpm条件下发酵40h，离心取ImL上清液测定酶 活。利用DNS法进行米根霉糖化酶酶活的鉴定结果如下。
[0026] 表1米根霉JHSTOl的糖化酶酶活实验结果
【主权项】
1. 一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废液中的应用，其特征在于：所述米根霉菌 株JHSW01，其分类命名为TfeizojOT1S 其保藏编号为CCTCC M 2015189。
2. 根据权利要求1所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废液中的应用，其特征在 于：将米根霉菌株JHSWOl接种到有机废液中，米根霉JHSWOl能将有机废液中的糖转化成乳 酸。
3. 根据权利要求1所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵有机废液中的应用，其特征 在于：发酵条件为：接种量为质量比〇. 5~5%，pH4~9，温度15°C ~45°C以上，发酵时间控制在 24~96h〇
4. 一株米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，其特征在于：所述米根霉 菌株JHSW01，其分类命名为TfeizojOT1S 其保藏编号为CCTCC M 2015189。
5. 根据权利要求4所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，其特征 在于：将米根霉菌株JHSWOl固体发酵菌剂按质量比0. 5%~5%加入到农林废弃物中，控制农 林废弃物的湿度为80%-100%进行发酵。
6. 根据权利要求4所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，其特 征在于：所述米根霉菌株JHSWOl固体发酵菌剂的制备如下：将米根霉JHSWOl接种到种子 培养基中进行培养获得种子培养液；将所述种子培养液接种到固体培养基中进行发酵培 养，按照质量比干燥农作物秸杆粉末：干燥林业废弃物粉末：氮源=5~8 :2~3 :1~2将三种 组分混合制得固体培养基，将所述种子培养液加水稀释获得种子稀释液，调PH9. 0,然后将 固体培养基和所述种子稀释液混合堆积培养，固体培养发酵条件为：湿度大于80%，温度 20~35°C，pH7~10,发酵48~72小时，当发酵堆表面布满米根霉菌株JHSWOl菌丝体后，获得米 根霉菌株固体发酵菌剂。
7. 根据权利要求4所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，其特征 在于：所述米根霉菌株JHSWOl发酵农林废弃物后的产物用于制备微生物肥料和饲料。
8. 根据权利要求7所述的米根霉菌株JHSWOl在用于发酵农林废弃物中的应用，其特征 在于：所述米根霉菌株JHSWOl与枯草芽孢杆菌按照菌体数量2 :1复配用于发酵农林废弃 物制备微生物肥料和饲料。
【专利摘要】本发明公开了一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用，所述米根霉（Rhizopus oryzae）的保藏编号是CCTCC M 2015189，本发明利用筛选到的米根霉可以用于发酵有机废液降低有机废液带来的污染，还可以用于发酵农林废弃物用于微生物肥料和饲料的生产，发酵后的农林废弃物尤其是农作物秸秆明显软烂，发酵体系pH明显下降。所述米根霉菌株生长条件宽泛，易于培养和存活，生产操作过程也比较简单。有利于发酵过程中生产效率和劳动效率的提高。CCTCC M 201518920150402
【IPC分类】C05F11-08, C02F3-34, D21C1-00
【公开号】CN104860401
【申请号】CN201510192773
【发明人】董桂秀, 张召佐, 范自龙
【申请人】稼禾生物股份有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月22日