纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶的制作方法

本发明涉及以纳米氧化铜作为模拟碱性过氧化物酶，在碱性条件下催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸，形成稳定的二聚体荧光产物，测定过氧化氢的荧光分析方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术：

天然酶作为生物催化剂，因其催化效率高、专一性强。反应条件温和而受到广泛的关注和应用，与生物体的生长、发育、繁殖等生命活动有着密切的联系。但由于天然酶的制备和纯化成本高、操作繁琐，价格昂贵，并且容易受到各种物理、化学因素的影响而失去活性，使其实际应用受到极大限制。纳米人工模拟酶相较于天然酶在高温、极端pH、高盐浓度等恶劣环境下依然能保持良好的催化活性，并且具有结构稳定、经济、易于大规模制备以及可调催化活性等优点，使纳米人工模拟酶成为生物医学应用中的有前景的工具。

过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，在许多生物系统中起关键作用，并且是生物分析和临床化学中的重要工具。过氧化氢是生化反应中重要的中间产物，所以对过氧化氢及其相关物质的精确测定具有重要意义。天然过氧化物酶及其模拟物通常在酸性或中性条件下发挥最佳性能。然而，在碱性条件下进行的研究很少。因此，碱性过氧化物酶模拟物的发现对于实际应用具有重要意义。

本发明基于纳米氧化铜作为模拟碱性过氧化物酶，在碱性条件下催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸产生二聚体荧光产物，提供一种以纳米氧化铜为催化剂测定过氧化氢的荧光分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的是基于纳米氧化铜作为模拟碱性过氧化物酶，在碱性条件下催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸产生二聚体荧光产物，提供一种以纳米氧化铜为催化剂测定过氧化氢的荧光分析方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：所述一种纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶，其特征是纳米氧化铜在碱性条件下催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸作为模拟碱性过氧化物酶；所述的纳米氧化铜由如下步骤制得：1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；2）快速加入0.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。

所述的一种纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶，其特征是将对羟基苯丙酸、过氧化氢、纳米氧化铜溶液和磷酸盐缓冲液四者混合温浴反应，反应产物具有荧光，最大激发波长和发射波长分别为320 nm和409 nm。

纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶最佳活性pH值为10.1~10.3。

纳米氧化铜对底物对羟基苯丙酸的米氏常数为0.68 mmol/L，对底物过氧化氢的米氏常数为5.4 mmol/L。

本发明基于纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶测定过氧化氢的荧光分析方法，其特征是将对羟基苯丙酸、过氧化氢、纳米氧化铜溶液和磷酸盐缓冲液四者混合温浴反应，测定荧光强度。

上述的纳米氧化铜由如下步骤制得：1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；2）快速加入0.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。

所述的一种基于纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶测定过氧化氢的荧光分析方法，其特征是将50 µL不同浓度的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸，200 µL浓度为2mg/L的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L、pH为10.25的磷酸盐缓冲溶液中，混合液在65 ℃温浴，45分钟后分别测定其在409 nm处的荧光强度，激发波长为320 nm，以荧光强度对过氧化氢浓度作图得到标准曲线。

荧光强度与过氧化氢浓度在0.05~0.4 mmol/L范围内呈线性关系，检测限为0.81 µmol/L。

所述的荧光反应体系的pH值优选为10.25，氧化铜浓度优选为0.4mg/L，对羟基苯丙酸浓度优选为4mmol/L。

所述的荧光反应温度优选为65℃，反应时间优选为45分钟。

本发明的技术方案具体步骤如下：

（一）纳米氧化铜的制备：

取醋酸铜溶液和冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾，快速加入氢氧化钠溶液，加完后，继续搅拌后，得到黑色氧化铜。将反应得到的黑色氧化铜立即离心，用无水乙醇洗涤，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。将纳米氧化铜粉体分散于二次蒸馏水中得到棕色纳米氧化铜胶体溶液。

纳米氧化铜具体制备步骤如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；

（2）快速加入0.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；

（3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得纳米氧化铜粉体。

（二）过氧化氢的测定

在EP管中依次加入过氧化氢溶液、对羟基苯丙酸、纳米氧化铜、磷酸盐缓冲液，将混合液放入65 ℃水浴。45分钟后测定其荧光强度，以荧光强度对过氧化氢浓度作图得到标准曲线以用于测定过氧化氢。

本发明的优点：

本发明纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶，在碱性条件下催化过氧化氢氧化对羟基苯丙酸产生二聚体荧光产物，纳米氧化铜对底物对羟基苯丙酸的亲和力高于辣根过氧化物酶。本发明纳米氧化铜模拟碱性过氧化物酶可用于过氧化氢的荧光分析，测定过氧化氢的线性范围为0.05~0.4 mmol/L，其检测限为0.81 µmol/L，具有灵敏度高，样品需求量少，重现性好，成本低等优点。。

附图说明

图1为反应体系的荧光光谱图。

图2为pH值对荧光强度的影响图。

图3为反应温度对荧光强度的影响图。

图4为反应时间对荧光强度的影响图。

图5为纳米氧化铜浓度对荧光强度的影响图。

图6为对羟基苯丙酸浓度对荧光强度的影响图。

图7为纳米氧化铜对于对羟基苯丙酸的稳态动力学曲线图。

图8为纳米氧化铜对于过氧化氢的稳态动力学曲线图。

图9为过氧化氢的标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于此。

实例1：

纳米氧化铜具体制备步骤如下：（1）取0.02 mol/L的醋酸铜溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到装有冷凝管的三颈瓶中，搅拌加热至沸腾；（2）快速加入0.04 g/ml的氢氧化钠溶液10 ml，加完后继续搅拌5分钟，得到黑色氧化铜沉淀；（3）将反应得到的黑色氧化铜沉淀离心，用无水乙醇洗涤三次，减压干燥，即得直径为6 nm的纳米氧化铜粉体。

实例2：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于65℃温浴，45分钟后测定其荧光光谱。如图1所示，荧光产物激发波长为320 nm，发射波长为409 nm。

实例3：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L不同pH的磷酸盐缓冲溶液（pH 9～11）中，混合摇匀后置于65℃温浴，45分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm）。如图2所示，荧光强度在pH为10.1~10.3之间达到最大值。

实例4：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于不同温度水浴（25℃～85℃）温浴，45分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm）。如图3所示，荧光强度在65℃时达到最大值。

实例5：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于65℃温浴，反应不同时间（0~75分钟）后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm）。如图4所示，荧光强度在45分钟时达到最大值。

实例6：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL不同浓度的实例1制备的纳米氧化铜溶液（0～5 mg/L）加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于65℃温浴，45分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm）。如图5所示，荧光强度随混合液中纳米氧化铜浓度增大而增大并在终浓度为0.4 mg/L时达到最大。

实例7：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL不同浓度的对羟基苯丙酸（0～80 mmol/L）和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于65℃温浴，45分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm）。如图6所示，荧光强度随混合液中对羟基苯丙酸浓度增大而增大，在终浓度为3.5 mmol/L时，荧光强度达到最大值。

实例8：

将50 µL浓度为120 mmol/L的过氧化氢溶液，50 µL不同浓度的对羟基苯丙酸（0～60 mmol/L）和200 µL浓度为2 mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于37℃温浴，1分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm），计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出纳米氧化铜对底物对羟基苯丙酸的米氏常数为0.68 mmol/L（见图7）。

实例9：

将50 µL不同浓度的过氧化氢溶液（1～120 mmol/L），50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于37℃温浴，1分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm），计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出纳米氧化铜对底物过氧化氢的米氏常数为5.4 mmol/L（见图8）。

实例10：

将50 µL不同浓度的过氧化氢溶液（0～8 mmol/L），50 µL浓度为80 mmol/L的对羟基苯丙酸和200 µL浓度为2mg/L的实例1制备的纳米氧化铜溶液加入到700 µL浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 10.25）中，混合摇匀后置于65℃温浴，45分钟后测定其在409 nm处的荧光强度（激发波长为320 nm），以荧光强度对过氧化氢浓度作图得到标准曲线。如图9所示，荧光强度与过氧化氢浓度在0.05~0.4 mmol/L范围内呈线性关系，检测限为0.81 µmol/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。