核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒的制备及其应用
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及化工技术领域，具体地说，是一种核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒的制备及其应用。
【【背景技术】】
[0002]蛋白质的可逆磷酸化修饰是最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式之一，调控着众多生理过程，如细胞分裂、细胞增殖、信号传导和新陈代谢等。据估计，在同一时刻有30%的蛋白质处于磷酸化修饰状态，所以对蛋白质的磷酸化机理的研宄对于蛋白组学十分重要。磷酸化蛋白的定量以及定性检测是了解这些过程的前提。如今，质谱已被证明是分析和鉴定蛋白质磷酸化位点的有效工具。然而，直接用质谱分析样品仍存在着许多问题。比如，磷酸肽在生物样品中含量低，质谱分析时离子化效率较低，同时存在大量非磷酸肽干扰信号。因此，在质谱分析复杂样品前，采用预富集方法进行样品前处理是十分重要的。
[0003]为了提高样品中磷酸肽的质谱信号，当前已发展了多种分离技术和富集材料用于富集磷酸肽和磷酸化蛋白，如金属氧化物亲和色谱法(MOAC)，固定金属离子亲和色谱法(IMAC)，强阳离子交换色谱法(SCX)和强阴离子交换色谱法(SAX)等。其中，固定金属离子亲和色谱法已成为一种最重要的技术，其基本原理是基于聚合物基质、多孔基质和纳米颗粒表面的金属离子与磷酸肽基团之间强烈的螯合作用。一系列的不同基质(如硅胶、聚合物、磁球、介孔微粒)的IMAC材料已被广泛应用于磷酸肽富集中。近年来，微孔IMAC材料由于其较大的比表面积，较大的孔体积，规整的孔结构而被广泛应用于磷酸肽研宄。邓等合成了一种多巴胺包裹的介孔硅材料，并在表面修饰有大量的Ti4+，对磷酸化蛋白的富集显示出较高的选择性，较低的检测限，较大的富集容量。尽管已有前人的研宄成果，设计合成出新型的带有大量作用位点以及易于分离的微孔IMAC材料仍然是磷酸化蛋白富集的一个研宄热点。
[0004]对于传统的IMAC技术，样品的分离需要高速离心，过程繁琐且目标磷酸肽丢失不可避免。作为一种替代技术，磁性基质因易于制备，便于分离得到了广泛的关注。近年来功能化的磁性纳米材料已被广泛应用于蛋白组学。对于磷酸肽的富集，研宄者设计出一系列的磁性纳米材料，大都显示出好的选择以及富集效率。微孔磁性IMAC材料具有大的比表面积，能提供更多的作用位点从而进一步提高富集效率。陆等制备了一种磁性介孔钛微球，具有大的比表面积，符合窄分布的孔径，较好的磁响应且对磷酸肽具有较好的特异性以及较大的富集容量。因此，迄今为止，设计新型的介孔磁性IMAC材料仍然是蛋白组学的研宄热点。
[0005]金属有机骨架材料是一类以金属离子为配位中心，与有机配体通过配位作用形成的多孔配位聚合物。金属有机骨架材料具有超高比表面积、超大孔体积、良好的热稳定性、介孔孔径、孔内和孔外易于修饰等优点，被广泛用于气体存储、催化、药物载体、吸附和分离等领域。因为MOF材料表面易于修饰，且具有孔特征，因此在蛋白组中的应用日渐广泛。此夕卜，由于nm级的孔径使得MOF材料对一些较大的蛋白具有体积排阻效应，并捕捉分子量较小的蛋白以及肽段。然而迄今为止很少有具有IMAC特性的MOF材料被用于磷酸肽的富集。邓等制备了一种基于锆离子的亲水MOF材料，此材料将磁球的易于分离，多巴胺的亲水性以及MOF材料的大的比表面积等优点结合，在磷酸化蛋白的富集中显示出较高的选择性以及富集效率，但是合成方法较为复杂。因此，用一种简单，有效的方法制备一种磁性的MOF材料对于磷酸肽的富集仍然是技术热点。
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【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒的制备及其应用。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]一种核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒的制备方法，其具体步骤为:
[0009](I) I?2g的三氯化铁和70?80mL的乙二醇和3?4g的柠檬酸钠进行均匀混合，在150?250°C进行高温水解反应，得到顺磁性的磁性纳米基质；
[0010](2)将300?400mg步骤⑴制备的顺磁性的磁性纳米基质分散在80?10mL乙醇溶液中，逐滴加入5?10 μ L的0.3?0.6mmol L—1巯基乙酸机械搅拌20?26小时，得到羧基修饰的磁性纳米颗粒，乙醇清洗2?3次；
[0011](3)将100?200mg步骤⑵中制备的羧基修饰的磁性纳米颗粒分散在5?1mL的1mmol T1FeCl3.6H20的乙醇溶液，室温下静置15?20min，所得纳米颗粒用乙醇清洗2?3次除去未被吸附的FeCl3.6H20 ;随后，把磁性纳米颗粒分散于5?1mL含1mmol1711，3，5-均苯三甲酸的乙醇溶液，在70°0下静置30?60min ;如此循环操作10?40次，得到磁性纳米颗粒在150°C下真空干燥12?24小时，得到核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒。
[0012]一种核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒在选择性富集内源性磷酸肽中的应用，其具体方法为:
[0013](I)将制得的核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒用水和乙腈分别清洗I?3次，去除残留的反应试剂；
[0014](2)将步骤⑴清洗后的核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒与0.8?1.2mg/L磷酸肽溶液例如α-酪蛋白(a-Casin)酶解液和酪蛋白(β-Casin)酶解液混合溶于体积比为1:1?3: 7的水和乙腈的混合溶液中，20?30°C条件下震荡孵育30?50min;利用磁分离对含有磷酸化蛋白或者多肽进行选择性富集和快速分离，实现对高丰度的多肽或蛋白进行的去除和低丰度的磷酸肽或蛋白的富集；
[0015](3)将步骤⑵中吸附多肽或蛋白的磁性金属有机骨架纳米颗粒用5%?10%氨水溶液进行洗脱，利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪对所富集的肽段进行定性定量分析。
[0016]与现有技术相比，本发明的积极效果是:
[0017]采用多层自主装法制备了核壳结构磁性金属有机骨架纳米颗粒，Fe3O4OMIL-1OO(Fe)，并将其应用于选择性富集样品中的磷酸化肽。完美的孔结构以及大量的Fe3+离子大大增加的材料与磷酸肽的作用位点，提高了材料的选择性，检测限，以及富集容量。选用牛血清白蛋白和酪蛋白酶解液考察了 Fe3O4麵IL-100 (Fe)纳米颗粒对肽段的吸附性能及对蛋白的排阻