专利名称：一种用于荧光标记细胞成像的衬底及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光标记细胞成像领域，涉及将一种具有高增强荧光特性有序可控的 六角梅花状银纳米帽结构衬底代替传统的载玻片应用于荧光标记细胞成像的技术，具体涉 及一种用于荧光标记细胞成像的衬底及其制备方法和应用。
背景技术：
荧光标记细胞成像作为一种重要的现代生命科学检测技术，荧光标记细胞成像技 术因其灵敏度高和直观可见等优点，已成为生物医学领域中重要的检测手段。荧光标记细 胞成像技术是通过将具有荧光探针(荧光基团或偶联上荧光团的化学试剂)，对细胞核、质 膜、细胞骨架中的亚细胞进行标记，再通过荧光显微镜观察对这些细胞结构直接进行观察。尽管荧光探针种类很多，并且具有较好的生物相容性和可进行多色标记的特点， 然而它们的消光系数相对于荧光纳米晶粒来说相对较小，并且稳定性差。在实际过程中，由 于样品的特殊性，荧光技术已有的灵敏度仍然不能满足所有测定的需要。虽然可以利用很 多生物化学方法提高荧光信号强度，但受制于荧光物种自身的量子产率、光解性等条件，增 强程度仍存在很大的局限性。因此，怎样提高灵敏度和光稳定性，使其应用范围更加扩大， 已成为一个重大的挑战。表面增强荧光作为一种方兴未艾的重要增强荧光技术崭露头角。表面增强荧光指 利用特殊结构的金属表面(以银最为突出)通过等离子体振荡和电磁场剪裁效应，使分布在 表面附近的荧光物种的荧光发射强度相对于自由态的荧光发射强度显著增强的现象。其增 强机理主要有两种1.激发效率提高。纳米结构金属表面的自由电子在一定频率的外界电 磁场作用下规则运动而产生的表面等离子体共振，极大地增强粒子周围的电磁场，使靠近 基质表面上的分子活化，激发效率提高，从而增强了荧光发射强度；2.辐射衰减速率增加。 荧光物种的辐射衰减速率发生改变，激发态的荧光物种回到基态过程中，辐射衰减速率值 增大。而在实际观测到的增强荧光一般是上述两种增强机理综合作用的结果。值得注意的 是后者作用的结果可降低荧光物种的激发态寿命，从而使其在激发态停留时间缩短，光稳 定性得以提高。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于荧光标记 细胞成像的衬底，以使其具有成本低、可重复性强、适合批量生产制造、可较大幅度提高荧 光信号的强度和耐光性等优点。本发明的另一目的是提供一种制备用于荧光标记细胞成像 的衬底的方法。本发明的第三目的是提供用于荧光标记细胞成像的衬底在荧光标记细胞成 像中的应用，尤其是在高灵敏和抗猝灭细胞成像中的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种用于荧光标记细胞成像的衬底，所述的衬底为有序可控的六角梅花状银纳米帽结 构衬底。
—种制备上述的用于荧光标记细胞成像的衬底的方法，包括以下步骤
(1)将铝片先后放入蒸馏水和丙酮中超声震荡，去除表面的吸附的杂质；
(2)将步骤(1)的铝片作阳极放入抛光液中在直流恒压15V的情况下进行电化学抛光 3min，其中，抛光液为高氯酸和乙醇体积比为1 :5的混合溶液；
(3)两步氧化法对经步骤(2)处理后的铝片进行腐蚀；铝片作阳极，钼片作阴极，恒定 电压分别设为40V，温度维持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液进行氧化；第一步氧化2h，再 将其放入等体积比的1. 8wt. %的铬酸和6wt. %磷酸混合溶液中，温度在75°C反应2h，再重 复第一步氧化过程，得到多孔氧化铝模板；
(4)在室温下氩气环境中，采用直流磁控溅射lOmin，将银溅射到多孔氧化铝模板表面 上，得到六角梅花状银纳米帽结构衬底。上述的用于荧光标记细胞成像的衬底在荧光标记细胞成像中的应用，具体使用方 法如下细胞培养及荧光标记利用通用的细胞培养技术对的细胞进行培养，然后选择所 需的荧光探针进行标记；细胞的增强荧光检测分析将增强荧光衬底置于细胞之上，根据 检测需要，通过荧光显微镜对细胞的特别组份进行观察。本发明提出一种有序可控的六角梅花状银纳米帽结构衬底代替传统的载玻片应 用于荧光标记细胞成像的技术，在多孔氧化铝表面溅射银以得到有序可控的银纳米帽衬 底，将已经过有机染料荧光体处理的细胞放置在银纳米帽衬底上，通过荧光显微镜进行观 察，从而进行高灵敏度、高选择性且直观、可视化地检测复杂生物细胞中的特别组份。有益效果本发明的利用具有高增强荧光特性的衬底代替传统的载玻片用于荧光 标记细胞成像的衬底，具有成本低、可重复性强，操作简单，适合批量生产制造，可较大幅度 提高荧光信号的强度和耐光性等优点。
图1为本发明中具有增强荧光的银纳米帽衬底代替普通载玻片应用于细胞荧光 检测的流程示意图。图2为本发明中银纳米帽基底P-FITC的紫外可见吸收光谱。图3为本发明中P-FITC附着于银纳米帽衬底和P-FITC附着于普通载玻片上的荧 光光谱。图4为本发明中P-FITC标记CHO细胞在银纳米帽衬底和载玻片的耐光性检测。激 发光光源为汞灯(光谱范围为450到490 nm)。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的解释。表面增强荧光作为一种重要的增强荧光技术，检测灵敏度的提高以及光学稳定性 的增强一直是人们研究的热点，表面增强荧光的研究将使荧光检测技术在细胞显微成像、 生物分子无损检测、自猝灭效应的消除、荧光共振能量转移免疫分析及单分子检测等领域 获得重要的应用。本发明利用以氧化铝模板制备的表面具有有序可控的梅花状银纳米帽衬底代替 传统的载波片，将荧光标记的细胞置于该银纳米帽衬底之上，通过荧光显微镜得到增强荧
4光后的细胞结构信息。为验证该增强荧光技术的实际增强效果，选用比较典型的鬼笔环肽_异硫氰酸荧 光素(P-FITC:—种多用途的荧光衍生物，广泛应用于细胞荧光标记)，并选用具有代表性 的两种细胞中国地鼠卵巢细胞(CHO，ATCCinumber :CRL_9618)和正常人体的纤维原细胞 (AG1522)。实施例1
1、有序可控的银纳米帽衬底的制备
(1)将铝片先后放入蒸馏水和丙酮中超声震荡，去除表面的吸附的杂质。(2)再将铝片作阳极放入抛光液中在直流恒压15V的情况下进行电化学抛光 3min，其中抛光液为高氯酸和乙醇体积比为1 :5的混合溶液。(3)用两步氧化法对经预处理的铝片进行腐蚀铝片作阳极，钼片作阴极，恒定电 压分别设为40V，温度维持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液进行氧化。第一步氧化2h，再将 其放入等体积比的1. 8wt. %的铬酸和6wt. %磷酸混合溶液中，温度在75°C反应2h，再重复 第一步氧化过程，得到多孔氧化铝模板。(4)在室温下氩气环境中采用直流磁控溅射lOmin，将银溅射到过孔氧化铝模板表 面上，得到六角梅花状银纳米帽结构衬底。2、细胞培养及荧光标记
(1 )CH0细胞在完全培养基中进行培养。培养基成分是45%的达尔伯克氏改良伊格尔培 养基(DMEM :Dulbecco，s Modified Eagle Medium)、45%F_12 禾Π 10% 胎牛血清。控温 37°C， 在95%空气和5%C02气氛中维持1天。(2) CHO细胞用磷酸盐缓冲剂冲洗2次。(3)在60cm的培养皿中，缓慢地将400 μ L的2%的多聚甲醛加入到磷酸盐缓冲剂， 在37°C下维持20min。再将培养基用该磷酸盐缓冲剂冲洗三次，再在Triton缓冲液(在磷 酸缓冲液中加入0. l%Triton-X100和1%胎牛血清)中通透，25°C下维持30min。(4)这时候加入P_FITC(Sigam Cat: P5282)工作溶液(在Triton缓冲液中加入 0. 1 μ L/mL P-FITC)，在 25°C下维持 25min。3、细胞的增强荧光检测分析
将增强荧光衬底置于CHO细胞之上，通过倒置荧光显微镜对待检测的细胞组份进行观 察。具体使用过程如图1所示，A对载玻片进行消毒，B将细胞吸附在载玻片上，C对固定的 细胞透化处理并用P-FITC染色，D增强荧光衬底覆盖在CHO细胞上，通过荧光显微镜进行 观察。如图2所示，为本发明中银纳米帽基底P-FITC的紫外可见吸收光谱。如图3所示， 为本发明中P-FITC附着于银纳米帽衬底和P-FITC附着于普通载玻片上的荧光光谱。如图 4所示，为本发明中P-FITC标记CHO细胞在银纳米帽衬底和载玻片的耐光性检测。激发光 光源为汞灯(光谱范围为450到490nm)。与将CHO细胞置于载玻片上的相比较，荧光探针 P-FITC在CHO细胞中的强度显著增强，耐光性大大提高。实施例2
有序可控的银纳米帽衬底的制备
(1)将铝片先后放入蒸馏水和丙酮中超声震荡，去除表面的吸附的杂质。
(2)再将铝片作阳极放入抛光液中在直流恒压15V的情况下进行电化学抛光 3min，其中抛光液为高氯酸和乙醇体积比为1 :5的混合溶液。(3)用两步氧化法对经预处理的铝片进行腐蚀铝片作阳极，钼片作阴极，恒定电 压分别设为40V，温度维持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液进行氧化。第一步氧化2h，再将 其放入等体积比的1. 8wt. %的铬酸和6wt. %磷酸混合溶液中，温度在75°C反应2h，再重复 第一步氧化过程，得到多孔氧化铝模板。(4)在室温下氩气环境中采用直流磁控溅射lOmin，将银溅射到过孔氧化铝模板表 面上，得到六角梅花状银纳米帽结构衬底。细胞培养及荧光标记
(1)纤维原细胞AG1522在含10%的小牛血清的α最基本营养基(α -MEM =Minimum Essential Medium, Alpha Modified)中培养。在95%空气和5% 二氧化碳的气氛中培养1 天，温度维持在37°C。(2)生长层由0. 01%胰蛋白酶分离并在新完全培养基中重新悬浮。(3) AG1522细胞用磷酸盐缓冲剂冲洗两次。(4)在60cm的培养皿中，缓慢地将400 μ L的2%的多聚甲醛加入到磷酸盐缓冲剂， 在37°C下维持20min。再将培养基用该磷酸盐缓冲剂冲洗三次，再在Triton缓冲液(在磷 酸缓冲液中加入0.1 % Triton-X 100和1 %胎牛血清)中通透，25°C下维持30 min。(5)这时候加入P_FITC(Sigam Cat: P5282)工作溶液(在Triton缓冲液中加入 0. 1 μ L/mL P-FITC)，在 25°C下维持 25min。细胞的增强荧光检测分析
将增强荧光衬底置于AG1522细胞之上，通过倒置荧光显微镜对待检测的细胞组份进 行观察。具体使用过程如图1所示，A对载玻片进行消毒，B将细胞吸附在载玻片上，C对固 定的细胞透化处理并用P-FITC染色，D增强荧光衬底覆盖在AG1522细胞上，通过荧光显微 镜进行观察。与将AG1522细胞置于载玻片上的相比较，荧光探针P-FITC在AG1522细胞中的强 度显著增强，耐光性大大提高。
权利要求
1. 一种用于荧光标记细胞成像的衬底，其特征在于所述的衬底为有序可控的六角梅 花状银纳米帽结构衬底。
2. 一种制备权利要求1所述的用于荧光标记细胞成像的衬底的方法，其特征在于，包 括以下步骤(1)将铝片先后放入蒸馏水和丙酮中超声震荡，去除表面的吸附的杂质；(2)将步骤(1)的铝片作阳极放入抛光液中在直流恒压15V的情况下进行电化学抛光 3min，其中，抛光液为高氯酸和乙醇体积比为1 :5的混合溶液；(3)两步氧化法对经步骤(2)处理后的铝片进行腐蚀；铝片作阳极，钼片作阴极，恒定 电压分别设为40V，温度维持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液进行氧化；第一步氧化2h，再 将其放入等体积比的1. 8wt. %的铬酸和6wt. %磷酸混合溶液中，温度在75°C反应2h，再重 复第一步氧化过程，得到多孔氧化铝模板；(4)在室温下氩气环境中，采用直流磁控溅射lOmin，将银溅射到多孔氧化铝模板表面 上，得到六角梅花状银纳米帽结构衬底。
3.权利要求1所述的用于荧光标记细胞成像的衬底在荧光标记细胞成像中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于荧光标记细胞成像的衬底及其制备方法和应用。该衬底为有序可控的六角梅花状银纳米帽结构衬底。该制备方法包括利用技术成熟的两步氧化法制备有序可控的多孔氧化铝，再利用磁控溅射技术将高纯银溅射到多孔氧化铝表面以得到具有有序可控的增强荧光衬底。本发明的利用具有高增强荧光特性的衬底代替传统的载玻片用于荧光标记细胞成像的衬底，具有成本低、可重复性强，操作简单，适合批量生产制造，可较大幅度提高荧光信号的强度和耐光性等优点。
文档编号B82B1/00GK102001619SQ20101051113
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者邱腾, 郎咸忠 申请人:东南大学