专利名称：复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，具体地说是用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱方法来测定复方丹参滴丸中有效成分的一种方法。
背景技术：
心脑血管疾病是严重危害人类的常见疾病。近年来，由于社会的发展，工作、生活、饮食结构及环境等的变化，心脑血管疾病呈上升趋势。对于心血管疾病的治疗，虽然中药单一靶点的作用强度低于西药，但其多途径、多靶点、动态整体治疗、毒副作用小的特性则远非西药所能企及，疗效确切的中成药的综合治疗效果要超过西药。复方丹参制剂多用来治疗心脑血管疾病，例如复方丹参片、复方丹参滴丸、冠心丹参滴丸等。这些复方丹参制剂(均含有丹参、三七)因其配方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者剂型不同，治疗效果也有所差异。另外，由于这些复方丹参制剂的质量控制方法不够全面，难以全面表征它们的物理化学特征。因此，对复方丹参制剂的提取精制方法、质量控制方法进行改进成为人们积极研究的课题。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。全国大部分地区均产。由于丹参因品种、产地、采收期不同而造成质量参差不齐，因而其制成品质量的稳定性也难以保证。目前，对丹参及其复方制剂的鉴定，往往是选取丹参的一、二个活性成分或指标成分进行含量测定，并以其含量多少来判定质量。例如，以丹参酮IIA含量(中国药典2000年版一部58页)或丹参素含量(张友芹等，中医药学报，2000，28(3)68)等来鉴别丹参药材的质量；以丹参酮来判定丹参品种和产地情况(裘飞君，中国现代应用药学，1998，15(5)16；胡世林等，中国中药杂志，1999，24(12)721)；用丹参素含量(严常开等，中国医院药学杂志，2000，20(10)600)、原儿茶醛含量(郑末晶等，中国药事，2000，14(4)254)或丹参酮IIA含量(林伟忠等，中成药，2000，22(11)766)等判别复方丹参制剂的质量，用丹参酮IIA含量鉴别不同厂家生产的复方丹参片的质量(邵水娟，中国药业，2000，9(7)27)等。已知的丹参的化学成分有几十种，其脂溶性成分大多为醌型红黄色物质，如丹参酮I、IIA、IIB，丹参醌A、B、C，丹参酸钾脂，异丹参酮I、II，隐丹参酮等。其水溶性成分大多为酚性醛、酚性酸、二萜酸，如丁二酸、丹酚酸A、B、C，3，4-二羟基苯甲酸等。此外，还分离出β-谷甾醇、维生素E等(王伯祥主编，中医肝胆病学，第一版，中国医药科技出版社，1993年，96页)。三七为五加科(Araliaceae)植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen，的干燥根，主产于云南、广西及四川等地，是我国珍贵的特产药材，常用中药。其味甘，微苦，性温，归肝、肾经，具有散瘀止血、消肿止痛的功效，传统用于治疗跌打损伤和各种出血性疾病。研究表明，三七主要含有皂甙、多糖、氨基酸等化学成分，其中皂甙部分是三七活血化瘀功效应用的物质基础，是三七主要的有效成分。三七总皂甙含有人参皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Bh1，三七皂甙R1、R2、R3、R4、R6等20余种皂甙成分。这些成分均属于达马烷型[Dammarane type]四环三萜皂甙，其中人参皂甙Rb1、Rg1，三七皂甙R1是含量最高的3个成分，三七皂甙R1是三七最具代表性特征的化合物。
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanical Drug(Draft).2000 August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从发展趋势看，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。
中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。如中国药典2000年版[一部]共收载602种药材及成药品种。其中有992个薄层色谱鉴别，308个品种有含量测定〔容量法、光谱法、液相色谱法、气相色谱法及薄层色谱扫描法〕，大多数品种有一般的检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效及安全性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga losideIV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小梁碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。
复方丹参滴丸是由丹参、三七为主要原料制成的滴丸制剂，临床上用于治疗心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、心肌缺血、微循环障碍所导致的各类疾病等，其治疗效果已经得到临床的验证，而是否能够保证药物的质量以及复方丹参滴丸中有效成分的含量，是决定复方丹参滴丸疗效的基础。如果用一、二种丹参的活性成分来说明复方丹参滴丸的内在质量，具有一定的片面性，更不用说无药效的指标成分了。要控制复方丹参滴丸的功效，只针对其一、二个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征中药质量。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。现在，对丹参中活性成分如丹参酮、丹参素等的测定方法较多，对三七中活性成分如三七皂甙Rg1，人参皂甙Rg1等测定方法较多，但如何能够从更宏观的角度对复方丹参滴丸制剂进行质量控制的宏观质量控制方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，通过此测定方法，可控制复方丹参滴丸质量。
本发明可以通过下述步骤实施(a)复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于氨水中，超声溶解，过滤膜，取滤液过填料的C-18小柱，甲醇氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于容量瓶，定容，离心备用；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为冰醋酸水溶液，流动相B为冰醋酸乙腈溶液；检测波长200～210nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
优选的本发明可以通过下述步骤实施，所述步骤(a)中所述的甲醇氨水溶液为5～40％甲醇0.5～10％氨水溶液。
进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于1～20mL1～8％的氨水中，超声溶解，过0.30～0.60μm滤膜，取2～10mL滤液过填料的C-18小柱，5～40mL8～35％的甲醇1～8％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用5～35ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于1～15mL容量瓶，定容，离心备用；所述步骤(b)中色谱条件进样量5～40μL；检测波长201～205nm；柱温20～40℃。
更进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施(a)复方丹参滴丸供试品溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于5～15mL2～6％氨水，超声溶解，过0.35～0.55μm滤膜，取2～10mL滤液过填料的C-18小柱，10～30mL10～30％的甲醇2～6％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用10～30ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于1～10mL容量瓶，定容，离心备用，进样量15～25μL；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为80％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为20％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；15分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；25分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；50分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；65分钟时，流动相A为42％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为58％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；75分钟时，流动相A为25％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为75％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min-1；检测波长202～204nm；柱温28～32℃；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
最佳的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸0.4～1.5g，溶于10mL4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5mL滤液过500mg填料的C-18小柱，20mL20％的甲醇4％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用20ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于5mL容量瓶，定容，离心备用；所述步骤(b)中色谱条件进样量20μL；流速0.8mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃。
本发明中，选用甲醇氨水溶液冲洗所获得的复方丹参滴丸指纹图谱效果优于水冲洗所获得的复方丹参滴丸指纹图谱的效果，其冲洗液甲醇氨水溶液在5～40％的甲醇0.5～10％氨水溶液的范围均有较好的效果；优选5～40mL8～35％的甲醇1～8％氨水溶液冲洗；进一步优选10～30mL10～30％的甲醇2～6％氨水溶液冲洗，最佳的20mL20％的甲醇4％氨水溶液冲洗。
按照本发明发明方法测定的是复方丹参滴丸中三七化学成分的指纹图谱，按照上述方法测定的指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积2％的吸收峰有13个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.87min，RSD为0.31％，峰面积为506.92，RSD为13.03％；2号峰，平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；3号峰，平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；5号峰，平均保留时间RT为23.29min，RSD为0.25％，峰面积为565.78，RSD为13.80％；6号峰，平均保留时间RT为24.48min，RSD为0.28％，峰面积为309.39，RSD为18.98％；7号峰，平均保留时间RT为29.00min，RSD为0.62％，峰面积为345.32，RSD为14.28％；8号峰，平均保留时间RT为41.21min，RSD为0.25％，峰面积为436.06，RSD为10.88％；9号峰，平均保留时间RT为42.94min，RSD为0.21％，峰面积为665.38，RSD为11.82％；10号峰，平均保留时间RT为44.16min，RSD为0.21％，峰面积为472.84，RSD为14.59％；11号峰，平均保留时间RT为45.68min，RSD为0.23％，峰面积为947.39，RSD为16.06％；12号峰，平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％；13号峰，平均保留时间RT为68.21min，RSD为0.13％，峰面积为622.91，RSD为10.39％；14号峰，平均保留时间RT为69.43min，RSD为0.12％，峰面积为820.24，RSD为12.94％；所述指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积5％的吸收峰有7个，分别为2号峰，平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；
3号峰，平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；9号峰，平均保留时间RT为42.94min，RSD为0.21％，峰面积为665.38，RSD为11.82％；11号峰，平均保留时间RT为45.68min，RSD为0.23％，峰面积为947.39，RSD为16.06％；12号峰，平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％；13号峰，平均保留时间RT为68.21min，RSD为0.13％，峰面积为622.91，RSD为10.39％；14号峰，平均保留时间RT为69.43min，RSD为0.12％，峰面积为820.24，RSD为12.94％；所述指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有3个，分别为2号峰，平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；3号峰，平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；12号峰，平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％。
上述复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法中，其用于梯度洗脱的流动相A溶液的配制比例是按体积比配制，流动相B溶液的配制比例是按体积比配制。
本发明对三七药材、复方丹参滴丸中间体中三七化学组分进行了测定，方法如下三七药材中三七化学组分高效液相指纹图谱获取方法，方法如下三七药材供试品的制备取药材于回流瓶中，加入蒸馏水回流提取，过滤，滤渣中加入蒸馏水，回流，合并滤液，定溶于，离心过滤，备用；精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱。
优选的三七药材中三七化学组分高效液相指纹图谱获取方法，方法如下三七药材供试品的制备称取药材2.5g于回流瓶中，加入蒸馏水50mL，回流1.5小时，过滤，滤渣中加入50mL蒸馏水，回流1小时，合并滤液，定溶于100mL量瓶中，离心过滤，备用；平行2份，进样量10μL；精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱；所述指纹图谱中，三七药材供试品的组分化学成分吸收峰有5个，其中单峰面积超过总峰面积2％的吸收峰有5个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.81min，RSD为0.06％，峰面积为539.57，RSD为17.73％；2号峰，平均保留时间RT为12.03min，RSD为0.02％，峰面积为2482.50，RSD为8.74％；3号峰，平均保留时间RT为20.16min，RSD为0.11％，峰面积为1514.5，RSD为12.02％；
4号峰，平均保留时间RT为23.04min，RSD为0.07％，峰面积为250.63，RSD为18.25％；5号峰，平均保留时间RT为28.42min，RSD为0.27％，峰面积为356.20，RSD为15.30％。
所述指纹图谱中，三七药材供试品的组分化学成分吸收峰有5个，其中单峰面积超过总峰面积5％的吸收峰有4个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.81min，RSD为0.06％，峰面积为539.57，RSD为17.73％；2号峰，平均保留时间RT为12.03min，RSD为0.02％，峰面积为2482.50，RSD为8.74％；3号峰，平均保留时间RT为20.16min，RSD为0.11％，峰面积为1514.5，RSD为12.02％；5号峰，平均保留时间RT为28.42min，RSD为0.27％，峰面积为356.20，RSD为15.30％。
所述指纹图谱中，三七药材供试品的组分化学成分吸收峰有5个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有3个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.81min，RSD为0.06％，峰面积为539.57，RSD为17.73％；2号峰，平均保留时间RT为12.03min，RSD为0.02％，峰面积为2482.50，RSD为8.74％；3号峰，平均保留时间RT为20.16min，RSD为0.11％，峰面积为1514.5，RSD为12.02％。
复方丹参滴丸中间体中三七化学组分高效液相指纹图谱获取方法，方法如下复方丹参滴丸中间体供试品的制备称取复方丹参滴丸中间体，溶于氨水，超声溶解，过滤膜，取滤液过C-18小柱，先用甲醇的氨水溶液洗，再用水洗，收集甲醇洗脱液于容量瓶，定容，离心备用；优选的复方丹参滴丸中间体中三七化学组分高效液相指纹图谱获取方法，方法如下复方丹参滴丸中间体供试品的制备称取复方丹参滴丸中间体0.1～0.5g，溶于10mL4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5mL滤液过C-18小柱，先用15ml20％的甲醇4％的氨水溶液洗，再用20mL水洗，收集甲醇洗脱液于5mL容量瓶，定容，离心备用；平行2份，进样量20μL；精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱；复方丹参滴丸中间体中三七组分化学成分吸收峰有12个，其中单峰面积超过总峰面积2％的吸收峰有11个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.85min，RSD为0.08％，峰面积为557.29，RSD为15.67％；2号峰，平均保留时间RT为12.10min，RSD为0.06％，峰面积为2728.83，RSD为16.66％；3号峰，平均保留时间RT为20.33min，RSD为0.08％，峰面积为3704.31，RSD为14.15％；
4号峰，平均保留时间RT为23.86min，RSD为0.07％，峰面积为272.69，RSD为12.54％；5号峰，平均保留时间RT为23.28min，RSD为0.08％，峰面积为369.12，RSD为21.52％；7号峰，平均保留时间RT为28.82min，RSD为1.36％，峰面积为289.16，RSD为17.71％；8号峰，平均保留时间RT为42.93min，RSD为0.07％，峰面积为239.14，RSD为18.84％；9号峰，平均保留时间RT为45.66min，RSD为0.06％，峰面积为445.17，RSD为19.56％；10号峰，平均保留时间RT为47.85min，RSD为0.06％，峰面积为723.59，RSD为14.24％；11号峰，平均保留时间RT为68.17min，RSD为0.03％，峰面积为407.66，RSD为10.86％；12号峰，平均保留时间RT为69.4min，RSD为0.03％，峰面积为476.31，RSD为15.46％。
复方丹参滴丸中间体中三七组分化学成分吸收峰有12个，其中单峰面积超过总峰面积5％的吸收峰有4个，分别为1号峰，平均保留时间RT为10.85min，RSD为0.08％，峰面积为557.29，RSD为15.67％；2号峰，平均保留时间RT为12.10min，RSD为0.06％，峰面积为2728.83，RSD为16.66％；3号峰，平均保留时间RT为20.33min，RSD为0.08％，峰面积为3704.31，RSD为14.15％；10号峰，平均保留时间RT为47.85min，RSD为0.06％，峰面积为723.59，RSD为14.24％。
复方丹参滴丸中间体中三七组分化学成分吸收峰有12个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有2个，分别为2号峰，平均保留时间RT为12.10min，RSD为0.06％，峰面积为2728.83，RSD为16.66％；3号峰，平均保留时间RT为20.33min，RSD为0.08％，峰面积为3704.31，RSD为14.15％；10号峰，平均保留时间RT为47.85min，RSD为0.06％，峰面积为723.59，RSD为14.24％。
本发明通过测定复方丹参滴丸、复方丹参滴丸中间体、三七药材的指纹图谱发现，三者中吸收峰数量并不完全相同，说明采用测定复方丹参滴丸产品的指纹图谱作为复方丹参滴丸质量控制标准比单独以三七成分的指纹图谱作为质量标准更能够客观的反映产品内在成分的有无与与含量，以全面控制产品的质量。
本发明的优点如下(1).以复方丹参滴丸中主要有效成分三七化学组分为指标建立起来的HPLC指纹图谱，代表着复方丹参滴丸大部分药理活性，能有效地表征复方丹参滴丸的质量。从而实现对复方丹参滴丸最大可能的化学成分进行检测，有利于对中药质量的全方面监控。
(2).以复方丹参滴丸中三七各有效成分指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定复方丹参滴丸整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价复方丹参滴丸的质量提供了新的对照标准，将为提高复方丹参滴丸及其他以丹参、三七为主要成分成方制剂的质量及疗效做出贡献。
(3).本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
本发明提供了一种复方丹参滴丸的检测方法，本发明是通过大量实验所得到的切实可行的方法，具有重复性。在本发明中通过高效液相、在相同测试条件下所获取的复方丹参滴丸中丹参化学组分高效液相指纹图谱、复方丹参滴丸中间体的丹参化学组分高效液相指纹图谱以及丹参药材指纹图谱的重合性好，测定重复性好，因此可通过将上述测定方法建立的复方丹参滴丸指纹图谱作为标准指纹图谱，其测定方法可作为含有丹参、三七制剂有效成分测定的标准指纹图谱，以鉴别其有效成分。
对于本领域技术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进。例如，使用不同的检测仪器所获得的测定结果可能有所不同，但只要使用本发明所述的质量控制方法，均在本发明保护范围之内。
下面给出三七药材HPLC指纹图谱、复方丹参滴丸中间体中三七HPLC指纹图谱、复方丹参滴丸中三七HPLC指纹图谱、不同来源的三七化学组分HPLC指纹图谱的对照，旨在进一步说明本发明，但并不对本发明限制。
图1 三七药材HPLC指纹图谱图2 复方丹参滴丸中间体中三七HPLC指纹图谱图3 复方丹参滴丸中三七HPLC指纹图谱图4 不同来源的三七化学组分HPLC指纹图谱的对照其中1为复方丹参滴丸2为复方丹参滴丸中间体3为三七药材具体实施方式
下面列举制备方面的实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例一(制备例)称取丹参41.06g、三七8.03g，加水煎煮二次，第一次4倍量水2小时，第二次3倍量水1小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为90％左右乙醇至乙醇含量为65％(20℃)，静置12小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.37(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片0.46g，与聚乙二醇-6000 18g混和均匀，加热至温度85℃，化料80分钟后，移至罐温保持在86℃的滴丸机滴罐中。药液滴至8℃液体石蜡中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。
实施例二(制备例)称取丹参59.36g、三七6.38g，加药材总量1.0％的碳酸钾，煎煮二次，第一次4倍量水2.5小时，第二次3倍量水1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为85％左右乙醇至乙醇含量为70％(20℃)，静置10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.35(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片0.34g，与聚乙二醇-6000 23g混和均匀，加热至温度89℃，化料100分钟后，移至罐温保持在85℃的滴丸机滴罐中。药液滴至8℃甲基硅油中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。
实施例三(制备例)称取丹参31.12g、三七9.21g，加水煎煮二次，第一次4倍量水1.5小时，第二次3倍量水1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为88％左右乙醇至乙醇含量为66％(20℃)，静置10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.40(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片0.50g，甘露醇90g、依地酸钙钠15g和蒸馏水15ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，制成粉针剂。
实施例四(制备例)称取丹参116.35g、三七58.21g，加药材总量2.0％的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次4倍量水2小时，第二次3倍量水1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为88％左右乙醇至乙醇含量为66％(20℃)，静置10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.40(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和降香油1.8g，与40g微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥35分钟，整粒，加入4g滑石粉，混匀，充于胶囊中，即得。
实施例五(制备例)称取丹参116.35g、三七58.21g，加水煎煮二次，第一次4倍量水2小时，第二次3倍量水1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为88％左右乙醇至乙醇含量为66％(20℃)，静置10小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.40(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片0.9g，与微晶纤维素120g、羟丙甲基纤维素40g、木糖醇5g、硬脂酸镁2g混合均匀，压片，即得。
实施例六(制备例)称取丹参140.35g、三七36.42g，加药材总量2.5％的碳酸氢钠，煎煮二次，第一次4倍量水2小时，第二次3倍量水1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至比重为1.19-1.20(75±1℃)时，加浓度为90％左右乙醇至乙醇含量为65％(20℃)，静置8小时，分离上清液，回收乙醇，浓缩至药液相对密度为1.35(55-60℃)，得丹参三七浸膏。取上述丹参三七浸膏和冰片1.0g，与46g微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥30分钟，整粒，加入4g滑石粉，混匀，压片，即得。
实施例七(复方丹参滴丸三七组分指纹图谱检测例)1、仪器与试剂仪器采用Agilent 1100液相色谱，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，DAD检测器，柱温箱，Chemstation工作站；BS210S电子天平(1/10-4g)(北京塞多利斯公司)、METTLERAE240电子天平(1/10-4g或1/10-5g)(梅特勒-托利多(上海)有限公司)、LD4-2离心机(4000r/min)(北京医用离心机厂)、数显恒温水浴锅(天津长风有限公司)、RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、SHE-(III)循环水式真空泵(巩义英峪予华仪器厂)、KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、HENGAO T&D过滤器(HENGGAO T&D)、合成纤维过滤膜(孔径0.45μm)(上海兴亚净化材料厂)；C18小柱(填料为C18H17液相色谱固定相，50～100目，天津化学试剂二厂出品。干法装柱600mg，柱内径1cm)。
试剂乙腈(色谱纯，美国墨克公司)，醋酸(优级纯)，娃哈哈纯净水。
2、供试品制备复方丹参滴丸供试品的制备称取实施例一中各批次复方丹参滴丸1.0g，溶于10ml4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5ml滤液过C-18小柱(500mg填料)，20ml水洗，收集甲醇洗脱液于5ml容量瓶，定容，离心备用。平行2份，进样量20μl。
复方丹参滴丸中间体供试品的制备称取实施例一中各批次丹参三七浸膏0.2g，溶于10ml4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5ml滤液过C-18小柱，先用15ml20％的甲醇4％的氨水溶液洗，再用20ml水洗，收集甲醇洗脱液于5ml容量瓶，定容，离心备用。平行2份，进样量20μl。
三七药材供试品的制备称取药材2.5g于回流瓶中，加入蒸馏水50ml，回流1.5小时，过滤，滤渣中加入50ml蒸馏水，回流1小时，合并滤液，定溶于100ml量瓶中，离心过滤，备用。平行2份，进样量10μl。
3、HPLC分析条件
Agilent SB-C18分析柱(4.6mm×250mm，Zorbax SB USCL010304)；流动相A相为0.01％(V/V)冰醋酸水溶液，B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液。流速0.8ml·min-1；检测波长203nm；柱温30℃。
梯度洗脱程序如下表Time A0.01％HAC-H2O(％)(v/v)B0.01％HAC-CH3CN(％)(v/v)0 8020156535256535405743505743654258752575复方丹参滴丸三七指纹图谱成分名称
共计对200余批复方丹参浸膏分别进行丹参、三七指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总如下三七指纹图谱部分
共计对200余批复方丹参滴丸分别进行丹参、三七指纹图谱分析，其相似度均在90％以上。现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总如下
三七指纹图谱部分
实施例八 复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法(a)复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于20mL5％的氨水中，超声溶解，过0.30μm滤膜，取10mL滤液过填料的C-18小柱，40mL10％的甲醇4％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用35ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于15mL容量瓶，定容，离心备用，进样量5μL；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为80％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为20％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；15分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；25分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；65分钟时，流动相A为42％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为58％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；75分钟时，流动相A为25％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为75％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱。
实施例九 复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法(a)复方丹参滴丸供试品溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于15mL6％氨水，超声溶解，过0.55μm滤膜，取10mL滤液过填料的C-18小柱，30mL30％的甲醇6％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用30ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液5mL容量瓶，定容，离心备用，进样量15μL；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为80％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为20％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；15分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；25分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；65分钟时，流动相A为42％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为58％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；75分钟时，流动相A为25％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为75％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱。
实施例十 复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法(a)复方丹参滴丸供试品溶液的制备称取复方丹参滴丸1.0g，溶于10mL4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5mL滤液过500mg填料的C-18小柱，20mL20％的甲醇4％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用20ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于5mL容量瓶，定容，离心备用，平行2份，进样量20μL；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为80％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为20％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；15分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；25分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；65分钟时，流动相A为42％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为58％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；75分钟时，流动相A为25％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为75％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到三七组分化学成分的指纹图谱；
所述指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积2％的吸收峰有13个，它们是1号峰平均保留时间RT为10.87min，RSD为0.31％，峰面积为506.92，RSD为13.03％；2号峰平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；3号峰平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；5号峰平均保留时间RT为23.29min，RSD为0.25％，峰面积为565.78，RSD为13.80％；6号峰平均保留时间RT为24.48min，RSD为0.28％，峰面积为309.39，RSD为18.98％；7号峰平均保留时间RT为29.00min，RSD为0.62％，峰面积为345.32，RSD为14.28％；8号峰平均保留时间RT为41.21min，RSD为0.25％，峰面积为436.06，RSD为10.88％；9号峰平均保留时间RT为42.94min，RSD为0.21％，峰面积为665.38，RSD为11.82％；10号峰平均保留时间RT为44.16min，RSD为0.21％，峰面积为472.84，RSD为14.59％；11号峰平均保留时间RT为45.68min，RSD为0.23％，峰面积为947.39，RSD为16.06％；12号峰平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％；13号峰平均保留时间RT为68.21min，RSD为0.13％，峰面积为622.91，RSD为10.39％；14号峰平均保留时间RT为69.43min，RSD为0.12％，峰面积为820.24，RSD为12.94％；所述指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积5％的吸收峰有7个，它们是2号峰平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；3号峰平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；9号峰平均保留时间RT为42.94min，RSD为0.21％，峰面积为665.38，RSD为11.82％；11号峰平均保留时间RT为45.68min，RSD为0.23％，峰面积为947.39，RSD为16.06％；12号峰平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％；13号峰平均保留时间RT为68.21min，RSD为0.13％，峰面积为622.91，RSD为10.39％；14号峰平均保留时间RT为69.43min，RSD为0.12％，峰面积为820.24，RSD为12.94％；所述指纹图谱中，复方丹参滴丸中三七组分化学成分吸收峰有14个，其中单峰面积超过总峰面积10％的吸收峰有3个，它们是2号峰平均保留时间RT为12.12min，RSD为0.34％，峰面积为2723.73，RSD为12.11％；3号峰平均保留时间RT为20.34min，RSD为0.23％，峰面积为1684.49，RSD为18.59％；12号峰平均保留时间RT为47.88min，RSD为0.25％，峰面积为1547.80，RSD为13.25％。
权利要求
1.一种复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征包括如下步骤(a)复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于氨水中，超声溶解，过滤膜，取滤液过填料的C-18小柱，甲醇氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于容量瓶，定容，离心备用；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为冰醋酸水溶液，流动相B为冰醋酸乙腈溶液；检测波长200～210nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.如权利要求1所述的复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤(a)中所述的甲醇氨水溶液为5～40％甲醇0.5～10％氨水溶液。
3.如权利要求1所述的复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤(a)中复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于1～20mL1～8％的氨水中，超声溶解，过0.30～0.60μm滤膜，取2～10mL滤液过填料的C-18小柱，5～40mL8～35％的甲醇1～8％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用5～35ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于1～15mL容量瓶，定容，离心备用；所述步骤(b)中色谱条件进样量5～40μL；检测波长201～205nm；柱温20～40℃。
4.如权利要求1所述的复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征在于(a)复方丹参滴丸供试品溶液的制备称取复方丹参滴丸，溶于5～15mL2～6％氨水，超声溶解，过0.35～0.55μm滤膜，取2～10mL滤液过填料的C-18小柱，10～30mL10～30％的甲醇2～6％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用10～30ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于1～10mL容量瓶，定容，离心备用，进样量15～25μL；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为80％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为20％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；15分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；25分钟时，流动相A为65％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为35％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；40分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；50分钟时，流动相A为57％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为43％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；65分钟时，流动相A为42％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为58％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；75分钟时，流动相A为25％的0.01％冰醋酸水溶液、流动相B为75％的0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min-1；检测波长202～204nm；柱温28～32℃；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
5.如权利要求1所述的复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤(a)中复方丹参滴丸溶液的制备称取复方丹参滴丸0.4～1.5g，溶于10mL4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5mL滤液过500mg填料的C-18小柱，20mL20％的甲醇4％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用20ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于5mL容量瓶，定容，离心备用；所述步骤(b)中色谱条件进样量20μL；流速0.8mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃。
6.如权利要求1、2或3所述的复方丹参滴丸指纹图谱的测定方法，其特征在于流动相A溶液的配制比例是按体积比配制，流动相B溶液的配制比例是按体积比配制。
全文摘要
本发明涉及复方丹参滴丸HPLC指纹图谱的测定方法，并通过大量实验建立复方丹参滴丸HPLC指纹图谱的方法及其标准指纹图谱。首先制备丹参滴丸供试品溶液，称丹参滴丸1.0g，溶于10mL4％氨水，超声溶解，过0.45μm滤膜，取5mL滤液过500mg填料的C－18小柱，20mL20％的甲醇4％氨水溶液冲洗，弃冲洗液，再用20ml水洗，弃水洗液，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于5mL容量瓶，定容，离心备用，进样量20μL；采用梯度洗脱，流动相A相为0.01％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.01％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.8mL·min
文档编号G01N30/60GK1670525SQ20051005526
公开日2005年9月21日 申请日期2005年3月17日 优先权日2004年3月17日
发明者程翼宇, 叶正良, 吴永江, 范骁晖, 王毅, 孙玉侠, 李淑菊 申请人:天津天士力制药股份有限公司