专利名称：禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST－ELISA检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及禽流感病毒血清抗体的aGST-ELISA检测方法。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，AI)是禽类的一种传染病或感染综合征，Perroncito于1878年在意大利首次报道了该病的发生，并称为鸡瘟。1955年Shafer证实该病是由A型流感病毒引起。100多年来，世界各地历次由特定的毒株引发的禽流感的流行或暴发，对养禽业和人类健康都造成危害，特别是高致病力禽流感，因其传播快，死亡率高，对家禽生产危害大，加上其重要的公共卫生意义，受到全世界的广泛重视，因此被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病，我国将其列为一类传染病。如何对其进行快速、准确的诊断，及时采取有效措施，是防制禽流感的重要课题。
禽流感的诊断方法分为病原检测和血清抗体检测方法。病原检测方法包括病毒的分离和鉴定、核酸检测技术、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光RT-PCR快速检测法、NASBA法、病毒编码酶检测法等，这些方法虽都有各自的优点，但也存在检测结果的不确定性和操作难度大以及所需设备条件等缺点，因而不适合实际应用。
血清抗体的检测方法是适用于鸡场快速诊断和进出口活体检测的技术，它能最大限度地满足禽流感发生地的流行病学调查、疫情监测的迫切需要。目前用于禽流感检测的血清学方法主要包括血凝和血凝抑制试验(HA/HI)、琼脂扩散试验(AGP)、免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
血凝和血凝抑制试验(HA/HI)特异性好，是禽流感亚型(H1-H15)鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，而且在进行HI试验时，使用的抗原和抗血清要避免神经氨酸酶同型，否则容易发生交叉反应，混淆检测结果。
免疫荧光技术(IFA)早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。用于禽流感病毒的诊断常用直接荧光抗体法，即在组织触片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光。IFA用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低。其敏感度同病毒的分离鉴定相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。该方法的缺点是标本中出现的假阳性(非特异性荧光)。
琼脂凝胶扩散试验(AGP)操作简单，即可以定性又可以定量。1970年Beard首次建立了用于禽流感抗原检测的AGP方法，AGP最常用的方法是免疫双扩散(IDD)。但AGP所用的抗原和抗体其中一种必须纯化，否则，敏感性较差，易出现假阳性结果。免疫单辐射扩散试验、单辐射溶血试验、对流免疫电泳等也常用于AIV及其抗体的检测，但这几种免疫沉淀试验都需在凝胶中进行，敏感性较差，对低滴度样品都会出现假阳性结果，而且AGP所需试剂及Ag、Ab的量较大，所以寻找更敏感的微量、快速的检测和诊断方法很有必要。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术。它具有敏感、特异、快速等特点，且需要的设备和技术条件不高，非常适用于目前的生产实际。ELISA和AGP一样均能检测亚型特异性抗原或抗体，其敏感性远远高于AGP和HI试验。早在1974年，欧洲国家就将ELISA用于流感的检测。1998年，我国确立了禽流感抗体间接ELISA检测方法和判定标准，为禽流感抗体的快速监测创造了条件。目前，我国建立的诊断禽流感的ELISA为(AIV-ELISA)及Dot-ELISA。利用该2项技术研制的试剂盒、具有敏感性高、特异性强、检出时间早、检出持续期长、速度快等特点，既可用于禽流感的早期诊断，又可用于抗体的监测，适合于现在禽流感抗体监测及流行病学调查。然而，抗原的纯度决定了检测的敏感性，上述技术中所用抗原是通过对有感染性的全病毒浓缩、纯化和灭活后得到的，而禽流感病毒是一种高度变异的病毒，尤其是象H5N1亚型的禽流感病毒具有很大的潜在危险，因而对抗原制备的生物安全性要求很高，难以在实际工作中推广。基于此，许多研究者试图将禽流感病毒的血凝素基因(HA)在大肠杆菌中表达，然后将纯化的表达产物作为包被抗原，以此建立间接ELISA。但由于HA基因的原核表达产物为不可溶蛋白，需要进行变性、复性才能获得纯化产物，而表达产物在变性、复性后，空间结构往往会发生一定程度的改变，致使检测方法的敏感性降低；此外，此种纯化方法得到的产物纯度无法达到建立ELISA的要求。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法，其抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产等特点，为进一步开发和研究禽流感检测试剂盒奠定基础。
一种禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法，其检测抗原为融合蛋白GST-HA1，所述GST-HA1的纯化方法是在酶联上用抗GST单抗捕获融合蛋白GST-HA1而得到高纯度的抗原。
所述抗GST单抗稀释度为120-180倍所述融合蛋白GST-HA1稀释度为2500-3600倍。
所述抗GST单抗稀释度为160倍，所述融合蛋白GST-HA1稀释度为3000倍。
本发明利用pGEX表达载体对禽流感HA1蛋白进行表达，得到不溶性的融合蛋白GST-HA1；然后利用单克隆抗体GST蛋白的特异性结合原理的，在酶联板上抗GST单抗捕获含有HA1的融合蛋白，直接获得高纯度的检测抗原。在检测过程中酶联板上是以抗GST单抗、融合蛋白、血清抗体、酶标二抗的顺序方式排布，因此将本发明检测方法称为双夹心ELISA方法，命名为aGST-ELISA。
本发明aGST-ELISA检测方法中，抗GST单抗及融合蛋白GST-HA1稀释度分别为120-180倍，2500-3600倍，最佳选择为160倍及3000倍。
本发明建立了“GST单抗—GST-HA1融合蛋白抗原-鸡抗HA抗体—HRP羊抗鸡二抗”的双夹心结构ELISA检测H5亚型AI血清抗体的方法，该结构的特点是在酶联板上利用GST单抗特异性地捕获GST-HA1融合蛋白抗原达到纯化的目的，不仅提高了包被抗原的纯度，而且消除常规方法对抗原结构的影响，这样不仅提高了抗原抗体反应的特异性，减少了假阳性结果，而且加强了抗原与血清抗体结合的能力。该方法对H5亚型AI阳性血清有高度的特异性，而与其他禽类常见疾病阳性血清无反应，在诊断过程中不会出现假阳性的结果。
该技术可用于禽流感血清抗体的检测，其优点是既克服目前常规的以原核表达产物作为包被抗原方法中需要将表达产物变性、复性的缺点，还有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产等特点，为进一步开发和研究禽流感检测试剂盒奠定基础。技术路线示意如图1。
图1aGST-ELISA技术路线示意2分泌抗GST单克隆抗体的杂交瘤细胞图3抗GST单克隆抗体的SDS-PAGE分析M.蛋白Marker1.纯化后的单抗图4抗GST单克隆抗体的Western-blot分析M.蛋白Marker1.GST-HA1 2.GST图5GST-HA1融合蛋白的SDS-PAGE分析M蛋白Marker 1.菌体裂解沉淀图6GST-HA1融合蛋白的Western-blot分析
M.蛋白Marker1.GST 2.GST-HA具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例一.实验材料1.分泌抗谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)单克隆抗体的杂交瘤细胞株由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室研制并保存，可对外发售。该细胞系经多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定，细胞生长旺盛，形态良好。细胞生长状态。(如图2)本发明所用抗GST单抗是自己制备的，本产品可从市场上购买。
2.含AIV HA1基因工程重组表达菌禽流感病毒A/goose/Guangdong/96(H5N1)的血凝素主要抗原部分HA1克基因隆到表达质粒pGEX-5x-1构建重组质粒(周雪媚，霍惠玲，张飚，李永清，王连群.禽流感病毒HA1基因的克隆及原核表达[J].动物医学进展，2006，27(1)66～69.)，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室研制并保存，可对外发售。
3.ELISA检测用试剂及溶液(1)辣根过氧化物酶羊抗鼠IgGSigma公司(2)辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgGSigma公司(3)包被液(碳酸盐缓冲液)Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6。
(4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)NaCl 8.00g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到7.4。
(5)封闭液5g脱脂牛奶用磷酸盐缓冲液溶解，定容至100mL。
(6)洗涤液含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
(7)稀释液0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液。
(8)底物缓冲液0.2mol/L Na2HPO4取Na2HPO4·12H2O 14.33g加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。
0.1mol/L柠檬酸取柠檬酸3.84g，加蒸馏水150mL，完全溶解后，定容至200mL。
(9)底物显色液0.2mol/L Na2HPO42.57mL0.1mol/L柠檬酸2.43mL蒸馏水5mL邻苯二胺(OPD) 4mg30％H2O21μL(10)终止液(2M H2SO4)22.2mL浓硫酸缓慢加入177.8mL蒸馏水中。
4.血清SPF鸟血清、火鸡H5亚型阳性血清、传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清、禽流感H5亚型阳性血清及CAV阳性血清，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室保存。
二.实验方法1.抗GST单克隆抗体的制备采用小鼠体内诱生法，取健康Balb/C雄性小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只，10-15天后使用。将细胞瓶中培养的阳性杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心10min弃上清液，收集细胞沉淀。用DMEM基础培养液将细胞沉淀悬浮，混匀，将细胞数调至106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5ml。密切观察动物的健康状况与腹水征象，接种细胞7～10天后产生腹水，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水收集到离心管中，10,000r/min离心10min，弃去上层的脂肪，石蜡油和下层的沉淀，小心抽去中层的淡黄色清凉液体，-20℃冷冻保存。
单克隆抗体效价和抗体亚类的测定。
经间接ELISA测定，腹水效价可达1∶819200，细胞上清为(1∶3200)。见表1。
表1 杂交瘤细胞上清和腹水中抗GST单克隆抗体的ELISA效价
用Sigma公司抗体亚类鉴定试剂(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA)，经间接ELISA检测，4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别属于IgG1和IgG2a。见表2。
表2 不同杂交瘤细胞分泌抗GST单克隆抗体的亚类
2.抗GST单克隆抗体的纯化辛酸—硫酸铵盐析法，辛酸在偏酸条件下能将血清中IgG外的蛋白质都沉淀下来，上清中只有IgG，具体方法如下(1)将腹水离心，取中间层，向一份腹水中加入两份0.06mol/L、pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCL调pH至4.5。
(2)于室温下搅拌在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL，4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀。
(3)上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10体积的pH7.4、0.1mol/LPBS、8.5％NaCl(用1mol/L的NaOH调pH至7.4。
(4)在4℃冰浴下30min内加入0.277g/ml的硫酸铵，使成45％的饱和度，静置1h以上。
4℃下12000r/min离心30min，弃上清。
(5)沉淀溶于适量含137mmol/LNaCL、2.6mmol/LKCL、0.2mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中，对50-100倍的上述PBS于4℃透析过夜。
(6)4℃12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，上清分装冻存。(如图3)结果表明采用辛酸—硫酸铵法纯化抗体，经12％的SDS-PAGE分析表明所获得的单克隆抗体纯度很高。
利用SDS-PAGE电泳测定单克隆抗体的分子量。根据分子量与迁移率的线形关系，计算出单克隆抗体的轻链分子量为22KD，重链分子量为53KD，单克隆抗体分子量为150KD。
3.抗GST单克隆抗体浓度的测定利用分光光度计测量纯化后的单克隆抗体浓度，记录在260nm和280nm的吸光值，计算蛋白浓度。按下面公式进行计算蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45×OD280nm-0.74×OD260nm结果见表3。
表3不同杂交瘤细胞分泌抗GST单克隆抗体的浓度
4.GST-HA1融合蛋白的制备与鉴定挑取含阳性重组表达质粒的重组菌的单菌落，接种于5mL Amp/LB培养基中，37℃活化过夜后，1∶100稀释到Amp/LB中，37℃、200r/min振摇培养至对数生长期(OD6000.6～1)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃、200r/min振摇诱导培养6-8h。10000r/min离心10min收集菌体。
将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中，超声破菌(超声30s，间歇30s，总共超声5min)。超声波裂解后12000r/min离心10min，上清即为可溶组分，沉淀为包涵体。弃上清后加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，用12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检查。(如图5)结果表明菌体裂解产物中，在62ku处有一明显条带，与理论值相符。
将诱导表达的融合蛋白GST-HA1和纯化的GST蛋白做10倍稀释后做SDS-PAGE电泳，电泳后将其转印在PVDF膜上，封闭后加入H5亚型禽流感阳性血清，充分反应后加入酶标二抗，底物DAB显色，进行Western-Blot分析。(如图6)结果表明融合蛋白能与血清中抗体特异性结合，而GST蛋白不与血清中抗体反应。
5.抗GST单克隆抗体特异性鉴定Western-Blot检测将空载体诱导表达的GST蛋白及未纯化的融合蛋白GST-HA1经SDS-PAGE电泳分离后进行电转印至NC膜。转印条件为15V下转印40min。
将经转印的NC膜转移至封闭液中，室温轻摇3h后，4℃封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液PBS-T洗膜一次(5min)；加入适当稀释度的一抗溶液(以封闭液1∶100稀释的SPF鸡阳性血清)中，室温下振荡1.5h；PBS-T洗膜3次，每次10min；转入适当稀释度二抗溶液(以封闭液1∶2000稀释的HRP-羊抗鸡IgG酶标二抗)中，室温振荡1.5h；PBS-T洗膜3次，每次10min；置于底物溶液，显色3-5min至条带清晰后迅速用蒸馏水终止。(如图4)结果表明抗GST单抗与GST(26KD)及GST-HA1(62KD)能特异性反应。
6.抗GST单克隆抗体和抗原包被浓度的确定用方阵滴定法确定最适工作浓度。将抗GST单克隆抗体以包被缓冲液从1∶10开始作倍比稀释，到1∶1280为止，每孔加100μl，37℃温育2h，4℃过夜。抗原用脱脂奶从1∶100开始倍比稀释，到1∶51200为止，每孔100μL，37℃温育1h，PBST洗板3次。加入1∶100稀释的AIV(H5N1亚型)阳性血清(血凝抑制效价HI＝25)，同时设立SPF鸡血清为阴性对照。酶标板37℃温育1h，PBST洗板3次，然后加入羊抗鸡酶标IgG作为二抗，37℃温育1h，PBST洗板3次，以OPD显色，最后加入终止液50μL/孔。酶标仪测490nm处OD值。由此初步确定aGST-ELISA工作条件。见表4。
表4aGST-ELISA的单抗和抗原的工作浓度
最后确定，本发明双夹心ELISA方法，纯化的抗GST单克隆抗体的最适稀释度为160倍稀释，融合蛋白GST-HA1的稀释度为3000倍稀释。
7.aGST-ELISA在检测血清样品中的应用采用双夹心ELISA方法。具体操作步骤如下(1)包被单抗最适工作浓度100μL/孔，37℃温育2h，4℃过夜，倒出孔内液体，加入200μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
(2)加封闭液100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。
(3)加入最适浓度的抗原，100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
(4)待测血清样品倍比稀释，100μL/孔，设2个加阴性血清孔为阴性对照，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μL/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
(5)加入抗鸡特异性抗体的酶标二抗，100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μL/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
(6)加人新鲜配制的底物溶液，100μL/孔，避光静置15min。
(7)加入终止液50μL/孔。酶标仪测490nm处OD值。血清效价定义为OD值大于或者等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数。融合蛋白与其他血清的交叉反应。
注本试验所用血清包括传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清、CAV阳性血清、禽流感H5亚型阳性血清(血凝抑制效价HI＝23-29)及阴性对照血清。所有血清均以100倍稀释，并作两个重复，加二抗后，OPD显色，读数。见表5。
表5 aGST-ELISA的特异性
aGST-ELISA检测结果显示，传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清及鸡传染性贫血阳性血清为阴性(P/N＜2.1)，只有禽流感H5亚型阳性血清孔为强阳性P/N≈7.5。
共对21份人工攻毒(H5N1亚型的AIV)火鸡血清样品进行检测，aGST-ELISA共检出阳性21例，阳性检出率为100％，H1检出20例，检出率为95％，且aGST-ELISA检出阳性结果和HI法阳性结果符合率为100％。由此可见，aGST-ELISA具有比HI更高的敏感性。
表6 火鸡血样检测结果
注所有血清样品先进行了1×100稀释另外，随机取2份火鸡血样，每份样品100倍稀释，然后分别测6孔，最后计算出批内变异系数。见表6表7 aGST-ELISA检测禽流感血清样品的稳定性
对随机取的2个样品，在一个板内分别测6孔，根据读数结果计算板内变异系数分别为0.03和0.04，表明aGST-ELISA有很好的稳定性。
结论本发明建立了“GST单抗—GST-HA1融合蛋白抗原-鸡抗HA抗体—HRP羊抗鸡二抗”的双夹心结构ELISA检测H5亚型AI血清抗体的方法，该结构的特点是在酶联板上利用GST单抗特异性地捕获GST-HA1融合蛋白抗原达到纯化的目的，不仅提高了包被抗原的纯度，而且消除常规方法对抗原结构的影响，这样不仅提高了抗原抗体反应的特异性，减少了假阳性结果，而且加强了抗原与血清抗体结合的能力。该方法对H5亚型AI阳性血清有高度的特异性，而与其他禽类常见疾病阳性血清无反应，在诊断过程中不会出现假阳性的结果。使用双夹心ELISA和HI两种方法对21份火鸡血清进行检测，结果表明双夹心ELISA法在检测血清抗体方面比HI具有更高的灵敏度，为成功检测鸡体内AI血清抗体奠定了基础。
权利要求
1.一种禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法，其检测抗原为高纯度融合蛋白GST-HA1，所述高纯度融合蛋白GST-HA1是在酶联板上用抗GST单抗捕获融合蛋白GST-HA1而制得。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述抗GST单抗稀释度为120-180倍。
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述融合蛋白GST-HA1稀释度为2500-3600倍。
4.根据权利要求1所述的检测方法，所述抗GST单抗稀释度为160倍，所述融合蛋白GST-HA1稀释度为3000倍。
全文摘要
本发明涉及“禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST－ELISA检测方法”，其检测抗原为高纯度融合蛋白GST－HA1，所述高纯度融合蛋白GST－HA1是在酶联板上用抗GST单抗捕获融合蛋白GST－HA1而制得。该方法可用于禽流感血清抗体的检测，其优点是既克服目前常规的以原核表达产物作为包被抗原方法中需要将表达产物变性、复性才能纯化的缺点，还有抗原制备工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产等特点，为进一步开发和研究禽流感检测试剂盒奠定基础。
文档编号G01N33/543GK1869703SQ20061008946
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月28日 优先权日2006年6月28日
发明者李永清, 张飚, 黄金海, 王宏俊 申请人:北京市农林科学院