专利名称：：利用磁性纳米颗粒分离靶成分的方法
技术领域：
：本发明涉及一种在生命科学、医学诊断等领域中从生物样品诸如血清或血浆中分离靶成分的方法。例如，本发明涉及一种从生物样品诸如血清或血浆中分离特定的脂蛋白级分的方法。本发明的方法能够用于测定HDL级分中胆固醇等的含量，这样的测定可用于进行临床检查。
背景技术：
：在血液中，脂质与脱辅基蛋白结合形成脂蛋白，然后脂蛋白被代谢。根据比重可将脂蛋白分为若干级分，诸如乳糜粒(CMs)，极低密度脂蛋白(VLDLs)，中等密度脂蛋白(IDLs)，低密度脂蛋白(LDLs)和高密度的脂蛋白(HDLs)。已知多种疾病影响这些脂蛋白的代谢，从而增加或降低血液中的脂蛋白级分。具体地，已知HDLs从多种组织，包括动脉壁获得胆固醇，并且参与积累在细胞中的胆固醇的去除作用，HDLs是多种动脉硬化，如冠状动脉硬化的危险防范因子，它在血液中的水平是预见动脉硬化发生的有用的指示剂。因此，在临床检查中进行对HDL级分中胆固醇的含量的测量，从而预防或诊断缺血性心脏病等。作为分离脂蛋白的方法，已知超速离心法、电泳法、凝胶过滤法等。因为这些方法要求非常复杂的程序，所以这些方法在临床检查中不经常使用。因而，在临床检査中经常使用的是一种沉淀法(分级法)。广泛而普遍地用作测定HDL胆固醇(下文中称为HDL-C)的方法是分级法，该方法涉及通过向样品添加分级剂来凝集除HDL外的脂蛋白，通过离心去除该脂蛋白，再测量仅含有分离的HDL的上清液中的胆固醇。为了测定HDL级分中胆固醇的含量，能够利用用于测定胆固醇含量的已知试剂来测量所收集上清液的HDL级分中含有的胆固醇含量。作为在上述沉淀法中所使用的沉淀剂，经常使用聚阴离子或聚阴离子和二价阳离子的组合。该聚阴离子的已知实例包括硫酸化的多聚糖如葡聚糖硫酸盐和肝素，磷钨酸及其盐，和聚乙二醇。二价阳离子的已知实例包括Mg2+，Mn2+，Ca2+和N产。然而，由于上述沉淀法涉及通过添加分级剂进行分离的操作，所以该方法在下列方面存在问题需要相对大量的样品，需要仪器，如离心机，且可能出现人为操作的误差。此外，所述沉淀(分级)法在应用于自动分析器时存在问题，而所述自动分析器在临床检查中经常使用。特别地，所述沉淀法要求通过离心来分级样品的步骤，这样该方法需要特定的处理时间以获得分析对象的级分。因此，很难使用该方法对大量样品进行快速分近期，一种不要求这些复杂的操作并能用在自动分析器中的直接方法已迅速传播开。例如，已知一种涉及使除HDL外的脂蛋白与用作凝集剂的环糊精硫酸盐完全反应，然后再容许利用聚乙二醇修饰的酶与之作用，从而特定地测量HDL中的胆固醇。然而，需要修饰环糊精以抑制除HDL外共存脂蛋白的反应以及利用高成本产品如酶和抗体。此外，已经报道了一种测定法，借此法并使用干的载玻片进行了沉淀法。然而，问题在于这样的载玻片的构造很复杂(日本专利公开(KoKai)号2005-49346A)。此外，该沉淀法也主要用在干式化学领域中，但是近期发明了利用直接方法的干式试样的新型技术。然而，这样的技术在生产过程中涉及非常复杂的步骤，且存在高成本的问题。日本专利公开(Kokai)号6-242110A(1994)公开了生物样品中特定脂蛋白级分中含有的一种成分的含量是通过下述步骤直接测定的凝集除了感兴趣的特定级分外的脂蛋白级分；使该成分与一种试剂反应，利用该试剂能够检测其含量待测定的成分；终止该反应的同时或其后，溶解所述凝集级分；并再测量由该反应所引起的变化。另外，日本专利号2913608公开了一种将样品中的第一类脂蛋白从该样品中的第二类脂蛋白中分离出来的方法。具体地，该方法涉及利用用于选择性化学沉淀的试剂来沉淀第二类脂蛋白，使该样品与磁反应性粒子(该磁反应性粒子诱发脂蛋白的沉降，所述脂蛋白已经随着所述粒子的沉降而沉淀)接触，将该样品置于磁场中直到所述磁反应性粒子沉降，从而沉降第二类沉淀的脂蛋白，并且因而容许第一类脂蛋白保留在该样品的上清液中。在这种方法的情形中，向脂蛋白添加沉淀剂如葡聚糖硫酸盐和磁性粒子引起除特定脂蛋白级分外的级分的沉淀。其次，当引起磁体作用于该产物，磁性粒子与该沉淀物形成混合物。该磁性粒子和该沉淀物共同沉淀并分离。所述磁性粒子是与脂蛋白不反应的磁体。最后，测定保留在上清液中的特定级分中胆固醇的含量。在另一方面，已经使用了利用磁性粒子的分离方法，且一些产品可商业获得(IatronCo.和OrthoClinical)。然而，由于这些方法使用具有大小为100nm或更大的磁性粒子，因此需要在立即将要使用前对其进行搅拌并证明其完全均匀。
发明内容本发明实现的目标是解决现有技术中的上述问题。具体地，本发明实现的目标是提供一种测定生物样品中特定脂蛋白级分所含成分含量的方法，该方法利用自动分析器，且不需要通过离心来分级样品的步骤。具体地，本发明实现的目标是提供一种测定HDL级分中胆固醇含量的有效方法。作为实现上述目标而进行的彻底研究的结果，本发明人发现了磁性纳米颗粒能够引起除特定脂蛋白级分外的脂蛋白级分的凝集，从而容许在使用磁场的条件下，从所述特定脂蛋白级分中容易地分离出该脂蛋白。本发明人还揭示了能够精确地测定靶成分的含量，这是通过检测保留在上清液中的特定级分中该成分进行的。由此，本发明人完成了本发明。由此，本发明提供一种分离生物样品中耙成分的方法，其包括以下步骤(1)使生物样品与独立分散的磁性纳米颗粒相接触，从而形成所述磁性纳米颗粒和能够与所述磁性纳米颗粒相互作用的生物分子的凝集物，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小的颗粒大小，且在其表面具有阴离子官能团；和(2)利用外部磁场收集所述凝集物。优选地，能够与磁性纳米颗粒相互作用的生物分子具有与所述磁性纳米颗粒的颗粒大小相同或比其更大的大小。优选地，所述磁性纳米颗粒的表面经如下分子式所代表的化合物所修饰R^-(OCH2CH2VO-L-X，其中R'代表Cl-24的烷基，n代表l-20间的整数，L代表单键或C1-10亚垸基，和X代表羧酸基团，磷酸基团，磺酸基团或硼酸基团。优选地，形成了生物样品中除特定脂蛋白级分外的脂蛋白与磁性纳米颗粒的凝集物，且利用外部磁场收集所述凝集物，从而分离该生物样品中所述特定脂蛋白级分。优选地，所述特定级分是高密度脂蛋白(HDL)。优选地，分离所述特定级分，从而测定所述特定级分中胆固醇的含量。优选地，在凝集促进剂的共同存在下使所述生物样品与磁性纳米颗粒相接触。优选地，使用聚阴离子作为所述凝集促进剂。优选地，所述聚阴离子是选自下列各项的聚阴离子磷钨酸、糊精硫酸盐、环糊精硫酸盐、杯芳烃或肝素。优选地，所述独立分散的，具有50nm或更小颗粒大小的磁性纳米颗粒是磁铁矿。本发明的另一个方面提供一种临床检查方法，其包括以下步骤(1)利用根据本发明的上述方法分离生物样品中的靶成分，和(2)测定由此分离的靶成分的含量。优选地，所述靶成分的含量是利用干式分析元素(dryanalyticalelement)观lj定白勺。本发明的另一个方面提供一种自动临床检查设备，其至少包括(1)容器，在所述容器中磁性纳米颗粒与生物样品相接触，从而形成凝集物，(2)磁场产生工具，其用于在容器内产生收集所述凝集物的磁场，和(3)干式分析元素，所述干式分析元素用于检测与所述凝集物分离的生物样品中的靶成分。本发明的另一个方面提供用于进行根据本发明的上述方法的检查试剂盒，其包括独立分散的的磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小颗粒大小，并且在其表面具有阴离子官能团。附图简述图1显示利用不具有级分辅助剂的级分溶液进行测量的结果。图2显示利用级分溶液进行测量的结果，所述级分溶液含有糊精硫酸盐作为级分辅助剂。本发明优选的实施方案本发明的实施方案将在下文中详细描述。根据本发明的分离生物样品中靶成分的方法包括以下步骤(1)使生物样品与独立分散的磁性纳米颗粒相接触，从而形成所述磁性纳米颗粒和能够与所述磁性纳米颗粒相互作用的生物分子的凝集物，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小的颗粒大小，且在其表面具有阴离子官能团；禾口(2)利用外部磁场收集所述凝集物。依靠使用本发明的方法，通过与磁性纳米颗粒的凝集能够将血液中除特定脂蛋白级分外的级分捕获，所述磁性纳米颗粒在其表面具有阴离子官能团，如羧酸。这些凝集物能通过磁体分离。随后，能够测定保留在上清液中的特定级分中胆固醇的含量。根据本发明的方法，生物样品中特定脂蛋白级分所含成分含量以如下方式快速测定。凝集除所述特定级分外的脂蛋白级分，使该产物与试剂或载玻片反应，利用该试剂或载玻片能够检测其量待测定的成分(保留在所述上清液中)，然后测量由该反应产生的产物。由此，能够测定所述特定脂蛋白级分所含成分的含量。这里，特定级分可为高密度脂蛋白(HDL)。而且，其量待测定的成分可为胆固醇。在本发明中，独立分散的具有50nm或更小颗粒大小的磁性纳米颗粒用于使除靶成分外的成分(例如，除特定脂蛋白级分外的级分)的凝集，所述磁性纳米颗粒在其表面具有阴离子官能团。"独立分散"指颗粒在溶液中不形成任何凝集物而独立分散的状态。另外，磁性纳米颗粒具有50nm或更小的颗粒大小，进一步优选地为40nm或更小，和特别优选地为30nm或更小。作为磁性纳米颗粒，能够使用任何颗粒，只要所述颗粒能够分散或悬浮在水性介质中并能够通过磁场的应用从分散液或混悬液中分离出来。用于本发明中的磁性纳米颗粒的实例包括铁、钴或镍的盐、氧化物、硼化物或硫化物；及具有高磁化率的稀土元素(赤铁矿和铁酸盐)。也能于此使用的这种磁性纳米颗粒的具体实例包括铁磁有序合金，如磁铁矿(Fe304),FePd，FePt和CoPt。本发明中优选的磁性纳米颗粒选自金属氧化物和具体地选自由氧化铁和铁酸盐(Fe,M)304所组成的组。这样的氧化铁的实例具体地包括磁铁矿、磁赤铁矿及其混合物。在上述分子式中，"M"代表当与铁离子结合使用时能够形成磁性金属氧化物的金属离子。该金属离子典型地选自过渡金属，且最优选地为Zn2+,Co2+，Mn2+,Cu2+，N产，Mg"等。M/Fe的摩尔比率根据所选择铁酸盐的化学计量成分测定。金属盐以固体或溶液形式提供，且优选地为氯化盐、溴化盐或硫酸盐。其中，氧化铁和铁酸盐在安全考虑方面是优选的。磁铁矿(Fe304)特别优选。用于本发明的磁性纳米颗粒在其表面具有阴离子官能团。阴离子官能团的实例包括羧酸基团，磷酸基团，磺酸基团和硼酸基团。特别地，羧基组是优选的。优选地，能够使用具有这样的表面的磁性纳米颗粒，所述表面经由分子式R、OCH2CH2)n-0-L-X代表的化合物所修饰。在该分子式中，W代表C1-24烷基，n代表l-20的整数，L代表单键或C1-10亚垸基，和X代表羧酸基团，磷酸基团，磺酸基团或硼酸基团。在本发明中，使磁性纳米颗粒与生物样品接触。依赖于所述生物样品，还可以使磁性纳米颗粒与所述生物样品在凝集促进剂存在下相接触。这里，凝集促进剂指诱导凝集的物质。适合的物质能够单独使用或联合使用，这依赖于待凝集级分的类型。针对除特定脂蛋白级分外的级分且引起免疫凝集反应的抗体也能用作凝集促进剂。可以使用任何的凝集促进剂，只要其能够完成本发明的目的。优选地加入聚阳离子或聚阴离子作为凝集促进剂，从而控制凝集的速度。例如，为了引起除HDL级分外的脂蛋白级分凝集的目的，可以使用聚乙二醇(PEG)和聚阴离子。磷钨酸，糊精硫酸盐，环糊精硫酸盐，杯芳烃，肝素等可以作为聚阴离子使用。这些可以单独使用或与阳离子，如Mg2、Mn2+，Ca2+，L产或N产联合使用。当在本发明中使用凝集促进剂时，糊精硫酸盐是特别优选的。根据本发明优选的实施方案，形成生物样品中除特定脂蛋白级分外的脂蛋白和磁性纳米颗粒的凝集物。再使用外部磁场收集所述凝集物，从而可以分离所述生物样品中的所述特定脂蛋白级分。此处所用的"特定级分"优选地指高密度脂蛋白(HDL)。在本发明中，可以分离特定级分，从而测定所述特定级分所含胆固醇的含量。作为用于检测和测定本发明中特定脂蛋白级分中所含成分含量的试剂，可以使用多种在临床检查等领域已知的试剂。例如，当用于胆固醇含量测定反应时(当测定HDL级分中胆固醇的含量时)，可以使用具有高反应特异性的称作酶方法的酶反应。这样的酶方法的实例包括涉及在使用胆固醇酯酶(CE)和胆固醇氧化酶(CO)与过氧化物酶(POD)和色原联合下测量可见区吸光度的方法；和涉及在使用CE和胆固醇脱氢酶(CHD)以及与辅酶联合下测量紫外区吸光度的方法。具体地，当测定HDL级分中胆固醇含量时，可以使用利用CE，CO和POD的试剂或利用CE和CHD的试剂。而且，HDL级分中胆固醇含量还能够利用含有上述试剂的干式分析元素进行测定。此外，本发明提供一种自动临床检查设备，其至少包括(1)容器，在所述容器中使磁性纳米颗粒与生物样品相接触，从而形成凝集物，(2)磁场产生工具，其用于在容器内产生收集所述凝集物的磁场，和(3)干式分析元素，其用于检测与所述凝集物分离的生物样品中的靶成分。在其中使磁性纳米颗粒与生物样品相接触从而形成凝集物的容器的类型和形状不受特殊限制。该容器可以是具有至少一个开口的一般的反应容器(包括试管等)。磁体等可以用作磁场产生工具。另外，可以使用含有用于检测耙成分的试剂的干式分析元素。当所述靶成分是胆固醇时，作为试剂，可以包含CE，CO和POD的联合或CE和CHD的联合。干式分析元素的构造不受特殊限制。例如，可以用于此处的干式分析元素具有这样的形式:至少一个功能层和至少一个展开层，且这些层以该顺序在平坦不透水支架的一侧分层，从而形成完整的层压材料。多种上述试剂还可存在于所述功能层中，如果必要，存在于所述展开层中。本发明将通过参考实施例进一步进行具体的描述。然而，本发明的范围不受这些实施例的限制。实施例实施例1:配制磁性纳米颗粒分散液将10.8g氯化铁(III)6-水合物和6.4g氯化铁(II)4-水合物溶解于并与80ml的IN的盐酸水溶液混合。随着搅拌该溶液，向该溶液中以2ml/分钟的速度加入96ml氨水(28wt.%)。随后在8(TC加热30分钟后，将所得产物冷却到室温。通过用水的滗析来纯化由此获得的凝集物。具有微晶尺寸约12mn的磁铁矿(Fe304)的产生由X-射线衍射法证实。将通过溶解2.3g聚氧乙烯(4，5)月桂基醚乙酸盐配制的100ml水溶液(其pH己经用NaOH调节为6.8)加入到上面所获得的凝集物中，从而分散所述凝集物。由此，配制了磁性纳米颗粒分散液。实施例2将10Pi磷鸨酸(0.2%或0.8%)加入到190具有含量为10.2g/l的Fe304的磁性纳米颗粒溶液中。此外，加入50u1标准血清(116mg/dlLDL-C和86.1mg/dlHDL-C)。利用涡流搅拌器搅拌所述溶液，然后容许在室温静置30秒。将该溶液转移到磁体上，再容许该溶液静置30秒。收集该上清液。利用LDL-C'HDL-C检测试剂盒(由KYOWAMEDEXCO.,LTD.生产)测定来源于各种脂蛋白的胆固醇的量。其结果在下表1中显示。LDL的分离与去除以及测定HDL含量的能力能够得到证实。(1)加入0.20%的磷钨酸(2)加入0.80%的磷钨酸表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3将10ul含有0.5%磷钨酸的0.1MMES缓冲剂(pH6.0)加入到190u1具有含量为3.62g/l的Fe304的磁性纳米颗粒溶液中。将50P1对照血清(119mg/dlLDL-C和26mg/dlHDL-C)加入到该溶液中。利用涡流搅拌器搅拌所述溶液，然后容许在室温静置30秒。然后将该溶液转移到磁体上，再容许该溶液静置30秒。收集该上清液，并将其点样在FUJIDRY-CHEMHDL-C-P载玻片(由FUJIPHOTOFILMCO.，LTD,生产)上。然后测定HDL胆固醇含量。此外，利用通过离心的分级获得上清液，该离心是利用与HDL-C-P载玻片共同提供的分级测试溶液(PR)进行的。收集该上清液，并将其点样在所述载玻片上。也显示了通过测定获得的数据。在用磁性纳米颗粒处理后测定的HDL-C测量结果为28.06mg/dl在用PR处理后测定的HDL-C测量结果为26.28mg/dl如上述结果所示，在利用FUJIDRY-CHEMHDL-C-P载玻片测定胆固醇含量中，通过利用磁性纳米颗粒的分级所获得的结果几乎与通过利用PR的常规方法所获得的相同。而且，预处理时间能够从20分钟縮短到1分钟。实施例4(不用级分辅助剂配制级分溶液)将40u1的0.2MMES缓冲剂(pH5.0)加入到120u1具有含量为15g/l的Fe304的磁性纳米颗粒(大小12-15nm)溶液中，从而配制级分溶液。将40ul样品加入到由此配制的级分溶液中，并搅拌该溶液。然后容许该溶液静置30秒。再将装有该混合溶液的容器放置于neodium磁体上，再容许其静置60秒。收集该上清液并点样于FUJIDRY-CHEMHDL-C载玻片(由FUJIPHOTOFILMCO.,LTD.生产)上。然后测定HDL胆固醇含量。为了比较，使用了由利用磷钨酸法测量该样品所获得的值。20个样品(N=20)的多重抽样相关性如图l所示。实施例5(利用糊精硫酸盐作为级分辅助剂配制级分溶液)将40u1的0.2MMES缓冲剂(pH5.0)禾卩10y1的0.4%糊精硫酸钠(MW500，000)(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)力卩入至U100u1具有含量为21g/1的Fe304的磁性纳米颗粒(大小12-15nm)溶液中，从而配制级分溶液。将50M样品加入到由此配制的级分溶液中，并搅拌该溶液。然后容许该溶液静置30秒。再将装有该混合溶液的容器放置于neodium磁体上，在容许其静置60秒。收集该上清液并点样于FUJIDRY-CHEMHDL-C载玻片(由FUJIPHOTOFILMCO.,LTD.生产)上。然后测定HDL胆固醇含量。为了比较，使用了由利用磷钨酸法测量该样品所获得的值。20个样品(N:20)的多重抽样相关性如图2所示。工业使用性通过本发明的方法，除特定脂蛋白级分外的脂蛋白级分能够在其凝集后利用磁场快速分离。因此，本发明的方法允许利用临床检查中的自动分析器通过直接使用常规检测法或干载玻片的测量。而且，本发明的方法能够显著程度地縮短分离和检测的测量时间。由此，本发明的方法在临床检査中非常有用。进一步，在本发明中，所述磁性非常小，且当使其静置时以不沉淀形式存在。因此，本发明的方法在如下方面是有利的在使用前无需搅拌操作和使该磁性均匀化。进一步，在本发明中，当除HDL外的脂蛋白形成凝集物时，该凝集物能够在l分钟内利用磁体沉淀，且由此本发明的方法适合于自动化过程。权利要求1.一种分离生物样品中靶成分的方法，其包括以下步骤(1)使生物样品与独立分散的磁性纳米颗粒相接触，从而形成所述磁性纳米颗粒和能够与所述磁性纳米颗粒相互作用的生物分子的凝集物，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小的颗粒大小，且在其表面具有阴离子官能团；和(2)利用外部磁场收集所述凝集物。2.根据权利要求1的方法，其中能够与所述磁性纳米颗粒相互作用的所述生物分子具有与所述磁性纳米颗粒的颗粒大小相同或比其更大的大小。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述磁性纳米颗粒的表面经如下分子式所代表的化合物所修饰RL(OCH2CH2VO-L-X，其中R1代表C1-24的垸基，n代表l-20间的整数，L代表单键或C1-10亚垸基，和X代表羧酸基团，磷酸基团，磺酸基团或硼酸基团。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其包括形成生物样品中除特定脂蛋白级分外的脂蛋白与磁性纳米颗粒的凝集物，且利用外部磁场收集所述凝集物，从而分离所述生物样品中的所述特定脂蛋白级分。5.根据权利要求4的方法，其中所述特定级分是高密度脂蛋白(HDL)。6.根据权利要求4或5的方法，其中分离所述特定级分，从而测定所述特定级分中胆固醇的含量。7.根据权利要求6的方法，其中在凝集促进剂的共同存在下使所述生物样品与磁性纳米颗粒相接触。8.根据权利要求7的方法，其中使用聚阴离子作为所述凝集促进剂。9.根据权利要求8的方法，其中所述聚阴离子是选自下列各项的聚阴离子磷钨酸、糊精硫酸盐、环糊精硫酸盐、杯芳烃或肝素。10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述独立分散的，具有50nm或更小颗粒大小的磁性纳米颗粒是磁铁矿。11.一种临床检查方法，其包括以下步骤(1)利用根据要求l-10中任一项的方法分离生物样品中的靶成分，和(2)测定由此分离的靶成分的含量。12.根据权利要求11的临床检查方法，其中所述靶成分的含量是利用干式分析元素测定的。13.—种自动临床检查设备，其至少包括(1)容器，在所述容器中使磁性纳米颗粒与生物样品相接触，从而形成凝集物，(2)磁场产生工具，其用于在容器内产生收集所述凝集物的磁场，和(3)干式分析元素，其用于检测与所述凝集物分离的生物样品中的靶成分。14.用于进行根据权利要求1-12中任一项的方法的检查试剂盒，其包括独立分散的磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小颗粒大小，并且在其表面具有阴离子官能团。全文摘要本发明实现的目标是提供一种测定生物样品中特定脂蛋白级分所含成分含量的方法，该方法利用自动分析器，且不要求通过离心分级样品的步骤。本发明提供一种分离生物样品中靶成分的方法，其包括以下步骤(1)使生物样品与独立分散的磁性纳米颗粒相接触，从而形成所述磁性纳米颗粒和能够与所述磁性纳米颗粒相互作用的生物分子的凝集物，所述磁性纳米颗粒具有50nm或更小的颗粒大小，且在其表面具有阴离子官能团；和(2)利用外部磁场收集所述凝集物。文档编号G01N33/92GK101189523SQ200680019430公开日2008年5月28日申请日期2006年6月29日优先权日2005年6月30日发明者小岛政芳,平井博幸,景山茂树,阿部义彦申请人:富士胶片株式会社