专利名称：评价对治疗性蛋白质的免疫应答的方法和产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及评价患者对治疗剂、尤其是治疗性蛋白质、例如VLA-4结 合抗体(例如那他珠单抗(natalizumab))的免疫应答。
背景技术：
生物治疗剂目前可用于治疗疾病和病症比如移植排斥、白血病、乳 癌、关节炎、多发性硬化和克罗恩氏病；并且其它许多基于蛋白质的治 疗正在开发中。可用的生物治疗剂包括AMEVIVE (alefacept)， ZEVALIN (ibritumomab tiuxetan) ， ORTHOCLONE
(muromonab-CD3 )， ENBREL ( etanercept )， REOPRO ( abciximab， 阿昔单抗)，RITUXAN ( rituximab ，利妥希玛)，SIMULECT
(basiliximab )， REMICADE (infliximab，英夫单抗)，SYNAGIS (帕 利珠单抗(palivizumab))， HERCEPTIN (trastuzumab ，司徒曼布)， ZENAPAX (达克珠单抗(daclizumab ) )， CAMPATH ( alemtuzumab ), MYLOTARG (吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin ) )， HUMIRA (阿 达木单抗(adalimumab))， AVONEX (干扰素卩-la )和TYSABRI
(natalizumab,那他珠单抗)。那他珠单抗是一种抗a4|51整联蛋白
(VLA-4)的人源化单克隆抗体。那他珠单抗结合a4pi和a邻7整联蛋白 的(x4亚基。那他珠单抗可用于治疗某些炎性疾病和病况，包括多发性硬 化、克罗恩氏病和类风湿性关节炎。
因为针对生物性治疗剂的免疫应答可能有临床后果，所以在生物治 疗剂领域，免疫原性测定的开发和确认具有极大的重要性。
发明内容
本发明提供用于鉴定、监测和/或评价针对治疗剂例如治疗性蛋白质
例如治疗性抗体的免疫应答的方法和组合物。患者产生针对治疗剂(比 如治疗性蛋白质或者治疗性抗体)的任何抗体的事实可能与针对所述治 疗剂的临床反应相关或不相关。本发明的一些方面是部分基于发现未预 料水平的抗体应答，其可以用作检测针对治疗剂的临床显著反应的阈 值。在一些实施方案中，所述阈值水平高于应用有关未接受该治疗剂患 者的统计学分析来预测的阈值水平。临床显著的阈值通常高于在患者中 可检测的最低免疫应答水平。例如，临床显著的阈值水平通常是在阴性
对照水平之上例如在未治疗患者群体的平均治疗前水平之上至少2倍标 准偏差。在一些实施方案中，相比阈值水平基于在还未接受治疗剂的患 者中观测到的免疫应答的5%截断值(例如，平均值之上1.645倍标准 偏差)时所鉴定的情况，本发明方法中所用的较高阈值水平导致较少的 假阳性。根据本发明的某些方面，在患者样品中存在可检测的免疫应答 不具临床意义，除非所述免疫应答至少达到预定的阈值水平。本发明还 提供鉴定针对治疗剂(例如，治疗性蛋白质，例如治疗性抗体)的抗体 应答之临床显著的阈值水平的方法，以及鉴定对治疗剂具有临床显著的 抗体应答的患者的方法。本发明的一部分还提供用来鉴定对象中有临床 意义之抗体的阈值水平。根据本发明的一些方面，针对治疗剂(例如， 那他珠单抗)的免疫应答可能不具临床显著性(例如，可能未显示出与 临床功效降低的显著相关性)，除非该免疫应答的强度达到可以预先确 定的(例如，基于从不同患者组获得的免疫应答)阈值水平。令人惊奇 的是，本文所述的方法不依赖于对从每个患者在治疗前后所获得的样品 进行比较，它们也不依赖于仅鉴定针对治疗剂的可检测免疫应答的存 在。相比而言，本发明的方法涉及检测至少阈值水平的针对治疗剂的免 疫应答，在此所述阈值水平可高于免疫应答的最低可检测水平，并且其 中所述测定的阳性结果具有临床意义，这部分地是因为该测定避免了没 有相关临床意义的假阳性。
目前，没有检测针对治疗性蛋白质的临床显著的抗体应答的通用技 术或者标准。不同的治疗性蛋白质可以诱导不同类型的抗体，这些抗体 的存在可能影响或者不影响治疗性蛋白质的安全性、药代动力学和/或 功效。监测患者针对治疗性抗体的反应的通行方法通常涉及比较每个患 者在治疗前后的血清抗体水平，鉴定任何可检测免疫应答的存在，以及 评价该患者以确定所述的可检测免疫应答是否与任何的安全性、药代动 力学和/或功效问题相关。相比而言，通过提供用于检测临床显著的阈
值水平应答的筛选测定方法，本发明的方法可用来鉴定具有临床显著的 免疫应答的那些患者。
根据本发明，针对治疗剂的临床显著的免疫应答是这样的抗体应答， 其可以影响患者的 一种或多种临床参数，和/或所述治疗剂的药代动力 学和/或功效。通常，临床显著的抗体应答指示所述治疗剂功效的减弱 或者缺乏功效，或者对所述治疗剂有不良反应。例如，对于多发性硬化，
针对治疗性蛋白质的临床显著的抗体应答包括以下一个或多个方面 (a)所述治疗剂在减少患者的数目、严重程度或者复发率方面的功效 缺乏或者功效降低至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或更多； (b ) 4吏所述治疗剂在残疾状态扩展评分表(Expanded Disability Status Scale, EDSS)得分或者多发性硬化综合功能评分表(Multiple Sclerosis Functional Composite, MSFC )得分中残疾进程减慢方面的功效缺乏或 者降低至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或更多；(c)在降低 新的或者新近扩大的T2高信号病变(T2 hyperintense lesion)的数量 或体积或者削弱在脑MRI上T2高信号病变体积增加方面的功效缺乏或 者降低至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或更多；(d)在降低 脑MRI上钆增强病变的数量或者体积方面的功效缺乏或者降低至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或更多；(e)在改善视觉功能方 面的功效缺乏或者降^(氐至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或更 多；(f)存在严重不良反应(例如，超敏反应，例如，过敏反应)。除 (f)以外，在施用所述治疗剂后规定时间内，例如3个月、6个月、9 个月或者至少一年内，评价这些应答。
在一方面，本发明提供鉴定临床显著的阈值水平的针对治疗剂(例 如治疗性蛋白质，例如治疗性抗体)的抗体应答的方法。所述方法包括
(a)评价患有病症的对照患者群体的抗治疗剂抗体的水平(例如，确 定至少2、 3、 5、 10、 20、 30、 50、 100名或更多患有病症的以及没有接 受目的治疗剂治疗已至少3个月、6个月或者更长时间的患者群体的抗 治疗剂抗体的平均值或者中值水平)；和(b)选择在所述对照群体的抗 治疗剂抗体水平之上至少2 (例如，2.5， 3， 4， 5或者6)倍标准偏差 的阈值水平。在已施用所述治疗剂的患者(已治疗患者)中存在的抗治 疗剂抗体的至少阈值水平与所述已治疗患者中临床显著的应答相关。优 选地，使用与在对照群体中用来鉴定抗治疗剂抗体水平的相周的检测剂
(例如，标记的抗治疗剂抗体)来评价已治疗患者。在一个实施方案中，
所述治疗剂是治疗性抗体，例如人源化21.6抗VLA-4抗体，例如那他 珠单抗。在一个实施方案中，所述病症是多发性硬化。在一些实施方案 中，所述病症是中枢神经系统的炎症(例如，除了多发性硬化之外或者 替代多发性硬化，脑膜炎、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica )、神经 性结节病(neurosarcoidosis )、 CNS脉管炎、脑炎或者横贯性脊髓炎)、 组织或器官移植排斥或者移植物抗宿主病、急性CNS损伤(例如，中 风或者脊髓损伤)；慢性肾病；变态反应(例如，变应性哞喘)；1型糖 尿病；炎性肠病(例如，克罗恩氏病或者溃疡性结肠炎)；重症肌无力； 纤维肌痛；关节炎病症(例如，类风湿性关节炎或者银屑病关节炎)； 炎性/免疫性皮肤病(例如，银屑病、白癜风、皮炎或者扁平苔藓(lichen planus));系统性红斑狼疾；Sjogren综合征；血液性癌症(例如，多 发性骨髓瘤、白血病或者淋巴瘤)；实体瘤比如肉瘤或者癌瘤(例如， 肺癌、乳癌、前列腺癌或者脑癌)；纤维化病症(例如，肺纤维化、骨 髓纤维化、肝硬化、系膜增生性肾小球肾炎、新月体肾小球肾炎、糖尿 病肾病或者肾性间质性纤维化)。在一些实施方案中，所述病症是涉及 a4卩l和/或a,7亚基调节的疾病。
在另一方面，本发明提供鉴定针对治疗性蛋白质(例如，治疗性抗 体)具有临床显著的抗体应答的患者的方法。所述方法包括从具有病症 并且已施用所述治疗性蛋白质的对象获得的生物学样品中鉴定与所述 治疗性蛋白质特异性结合的一种或多种抗体的阈值水平的存在，其中所 述阈值水平是在对照群体(例如，具有所述病症但是在最近3个月、6 个月或更长时间内没有施用所述治疗性蛋白质的患者群体)中特异性结 合所述治疗性蛋白质的抗体水平之上至少2 (例如，2.5、 3、 4、 5或6) 倍标准偏差。在一个实施方案中，所述治疗性蛋白质是治疗性抗体，例 如，人源化21.6 (也被称作AN100226)抗-VLA-4抗体，例如，那他珠 单抗。在一个实施方案中，所述病症是多发性硬化。在一些实施方案中， 所述病症是类风湿性关节炎。在某些实施方案中，所述病症是克罗恩氏病。 在一个实施方案中，所述方法还包括调整由此,皮鉴定为对治疗性蛋白质具 临床显著抗体应答的患者的治疗方案。
在一个方面中，本发明提供用于从对象获得的生物学样品中鉴定是否 存在具有临床显著水平的一种或多种抗体的方法和组合物，所述抗体特异 性结合被施用给所述对象的治疗性VLA-4结合抗体。本发明的一些方面包 括应用ELISA测定来检测诱导抗体的水平，所述诱导抗体指示在对象中针对施用治疗性VLA-4结合抗体的临床显著免疫应答。在一个实施方案中， 本发明提供用于鉴定临床显著水平的抗那他珠单抗抗体的方法和试剂盒， 所述抗那他珠单抗抗体指示在已接受至少 一剂量那他珠单抗的对象中针 对那他珠单抗的免疫应答。
在一个方面中，本发明提供基于对象针对VLA-4结合抗体的免疫应答 来评价和/或调整治疗方案的方法。
根据本发明的一个方面，提供了检测对象中针对VLA-4结合抗体的临 床显著的免疫应答的方法。所述方法包括确定来自已施用VLA-4结合抗体 之对象的生物样品是否包含临床显著的阈值水平的结合VLA-4结合抗体 的可溶性抗体，其中至少阈值水平的所述可溶性抗体的存在指示针对 VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。在一些实施方案中，由在不同时 间点上采自对象的至少两个生物学样品中存在至少阔值水平的针对 VLA-4结合抗体的可溶性抗体来指示针对所述VLA-4结合抗体的临床显 著的免疫应答。在某些实施方案中，所述时间点分开至少一个月。在一些 实施方案中，在两个连续时间点上采自对象的两个生物学样品中存在至少 阈值水平的结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体。在一些实施方案中，通过 以下来测定结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平确定在所述生物学 样品的第一等分试样中针对VLA-4结合抗体的可溶性结合活性的水平；和 确定所述可溶性结合活性是否对所述VLA-4结合抗体具有特异性。在某些 实施方案中，在所述生物学样品的第二等分试样中确定所述可溶性结合活 性的特异性。在一些实施方案中，通过以下来确定生物学样品中结合 VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平比较在存在两种或多种不同量的未 标记VLA-4结合抗体的情况下测量的对标记VLA-4结合抗体的结合活性 的水平(例如，可以将在不存在未标记VLA-4结合抗体的情况下测量的水 平和在存在竟争量的未标记VLA-4结合抗体的情况下测量的水平进4亍比 较)。在某些实施方案中，通过比较在存在两种或多种不同量的可溶性 VLA-4结合抗体的情况下测量的针对固定化VLA-4结合抗体的结合活性 的水平(例如，可以将在不存在可溶性VLA-4结合抗体情况下测量的水平 和在存在竟争量的可溶性VLA-4结合抗体情况下测量的水平进行比较)来 确定在生物学样品中结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平。在一些实 施方案中，在存在第一量未标记VLA-4的情况下测量的针对标记VLA-4 结合抗体的结合活性的第一水平与在存在第二量未标记VLA-4结合抗体 的情况下测量的针对标记VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平进行比
较。在一些实施方案中，在所述生物学样品的第一和第二等分试样中确定
结合活性的第一和第二水平。在某些实施方案中，应用桥连ELISA测定法 确定针对VLA-4结合抗体的可溶性抗体的量。在一些实施方案中，在对所 述生物学样品的第一等分试样的第一免疫测定中确定针对VLA-4结合抗 体的结合活性的第一水平，以及在对所述生物学样品的第二等分试样的第 二免疫测定中确定针对VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平，其中第二 免疫测定掺入比第一免疫测定更大量的未标记可溶性VLA-4结合抗体，并 且其中如果结合活性的所述第 一水平大于参考水平以及结合活性的所述 第二水平小于结合活性的所述第一水平的预定百分比的话，就表明在所述 生物学样品中存在至少阈值水平的针对VLA-4结合抗体的可溶性抗体。在 某些实施方案中，所述参考水平是关于参考量的针对VLA-4结合抗体的可 溶性抗体而测量的结合活性水平。在一些实施方案中，所述参考量是约500 ng/ml(例如，在血清样品中)的针对VLA-4结合抗体的可溶性抗体。例 如，所迷参考量可以在约400 ng/ml至约600 ng/ml之间(例如，约400 ng/ml，约425 ng/ml ，约450 ng/ml ，约475 ng/ml ，约500 ng/ml ，约525 ng/ml ， 约550ng/ml，约575 ng/ml或者约600 ng/ml )。应当理解，与所述参考量 对应的结合活性的所述参考水平可以在稀释样品(例如，样品对应于10 倍稀释，并含有约40 ng/ml至约60 ng/ml例如约50 ng/ml的针对VLA-4 结合抗体的可溶性抗体)中进行测量。可通过与所述参考量的适当稀释度 相对应的任何预定量的针对VLA-4结合抗体的可溶性抗体来提供测定中 结合活性的参考水平。在某些实施方案中，VLA-4结合抗体是针对VLA-4 的人源化的鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，所述VLA-4结合抗体是人 源化形式的鼠抗体mAb21.6 (例如，AN100226)。在一些实施方案中，所 述VLA-4结合抗体是那他珠单抗。在一些实施方案中，针对VLA-4结合 抗体的可溶性抗体是参考抗体，其以高亲和性与那他珠单抗结合。在一些 实施方案中，所述参考抗体阻断那他珠单抗和VLA-4之间的相互作用。在 某些实施方案中，所述的第一和第二免疫测定是桥连(bridging) ELISA 测定。在一些实施方案中，所述第一和第二测定中包括固定化的未标记 VLA-4结合抗体和可溶性的标记VLA-4结合抗体，其中所述可溶性的标 记VIA-4结合抗体用酶、荧光标记物、生物素标记物(例如，VLA-4结 合抗体可以4皮生物素化)或者放射性标记物进行标记。在一些实施方案中， 在单一反应基底上在平行反应体积中实施第一和第二免疫测定。在一些实 施方案中，所述生物学样品是血清样品。在某些实施方案中，所述对象是 人患者。在一些实施方案中，所述患者具有多发性硬化。在一些实施方案
中，所述患者具有类风湿性关节炎。在某些实施方案中，所述患者具有克 罗恩氏病。在一些实施方案中，从所述对象获得至少两个或多个生物学样
品的时间点分开至少15天、30天、45天、60天、卯天或更长时间。在某 些实施方案中，所述方法还包括，如果在从所述对象获得的至少两个生物 学样品中检测到结合VLA-4结合抗体的临床显著阈值水平的可溶性抗体， 选择针对所iW象的治疗方案。在一些实施方案中，选择治疗方案包括评 价所M象当前的疗法，确定针对所i^t象的新疗法，调整所M象的当 前疗法，或者停止所述对象的当前疗法。在一些实施方案中，当前疗法包 括给对f^fe用VLA-4结合抗体。
根据本发明的另一方面，提供选择针对对象的治疗方案的方法。所述 方法包括，测定已施用VLA-4结合抗体的对象在第一和第二时间点上是否 存在针对VLA-4结合抗体的阳性免疫应答，基于在第一和笫二时间点的测 定结果选择针对所M象的治疗方案，其中在一时间点从对象获得的生物 学样品中存在至少临床显著的阈值量的结合活性指示在所述时间点上存 在阳性免疫应答。在一些实施方案中，所述第一和第二时间点分隔开临床 显著的时间段。在某些实施方案中，临床显著的时间段为至少30天。在一 些实施方案中，如果在第二时间点检测到阴性免疫应答，就继续VLA-4 结合抗体治疗。在一些实施方案中，如果在第一和第二两个时间点上都检 测到阳性免疫应答，就选择不同于VLA-4结合抗体治疗的疗法。在一些实 施方案中，所M象具有多发性硬化。在某些实施方案中，所述对象具有 克罗恩氏病。在一些实施方案中，所述对象具有类风湿性关节炎。
仍根据本发明的另一方面，提供选择针对对象的治疗方案的方法。所 述方法包括检测从对象获得的至少两个生物学样品中是否存在针对 VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答，其中所述对象已施用了 VLA-4 结合抗体并且是在由至少临床显著的时间间隔分开的时间点上从所述对
象获得至少两个生物学样品，以及基于在从所述对象获得所述至少两个生 物学样品的时间在所述对象中针对VLA-4抗体的临床显著的免疫应答的 检测来选择治疗方案。在一些实施方案中，将从所述对象获取样品的时间 分开的临床显著的间隔为至少15天、30天、45天、60天、卯天或更长时 间。在某些实施方案中，选择治疗方案包括评价所述对象的当前疗法，确 定对于所i^t象的新疗法，调整所iW象的当前疗法或者停止所^t象的 当前疗法。在一些实施方案中，当前疗法包括给所ii^"象施用VLA-4抗体。 在一些实施方案中，检测是否存在针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫
应答包括，确定从已施用VLA-4结合抗体的对象获得的生物学样品是否包 含阈值水平的结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体，其中存在至少阈值水平 的可溶性抗体指示针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。在某些实 施方案中，至少阈值水平的结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体存在于在两 个连续时间点从所述对象获取的两个生物学样品中。在一些实施方案中， 通过以下来确定结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平确定在所述生 物学样品的笫一等分试样中针对VLA-4结合抗体的可溶性结合活性的水 平，以及确定所述可溶性结合活性是否对VLA-4结合抗体有特异性。在一 些实施方案中，在相同生物学样品的第二等分试样中确定所述可溶性结合 活性的特异性。在某些实施方案中，通过比较在存在两种或多种不同量的 未标记VLA-4结合抗体的情况下测量的针对标记VLA-4结合抗体的结合 活性的7jc平(例如，可以将在不存在未标记VLA-4结合抗体情况下测量的 水平和在存在竟争量的未标记VLA-4结合抗体情况下测量的水平进行比 较)来确定在生物学样品中结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平。在 一些实施方案中，通过比较在存在两种或多种不同量的可溶性VLA-4结合 抗体的情况下测量的针对固定化VLA-4结合抗体的结合活性的水平(例 如，可以将在不存在可溶性VLA-4结合抗体情况下测量的水平和在存在竟 争量的可溶性VLA-4结合抗体情况下测量的水平进行比较)来确定在所述 生物学样品中结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平。在一些实施方案 中，将在存在第一量的未标记VLA-4的情况下测量的针对标记VLA-4结 合抗体的结合活性的第一水平与在存在第二量的未标记VLA-4结合抗体 的情况下测量的针对标记VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平进行比 较。在某些实施方案中，在同一生物学样品的第一和第二等分试样中确定 结合活性的所述第一和第二水平。在一些实施方案中，应用桥连ELISA 测定法确定针对VLA-4结合抗体的可溶性抗体的量。在一些实施方案中， 在对所述生物学样品的第一等分试样的第 一免疫测定中确定针对VLA-4 结合抗体的结合活性的笫 一水平，以及在对所述生物学样品的第二等分试 样的笫二免疫测定中确定针对VLA-4结合抗体的结合活性的第二7jC平，其 中第二免疫测定掺入比第一免疫测定更大量的未标记可溶性VLA-4结合 抗体，并且其中如果所述的结合活性的第一7jC平大于参考水平以及所述的 结合活性的第二水平小于所述结合活性的第一水平的预定百分比的话，就 指示在所述生物学样品中存在至少阈值水平的针对VLA-4结合抗体的可 溶性抗体。在一些实施方案中，所述参考水平是对参考量的针对VLA-4 结合抗体的可溶性抗体所测量的结合活性水平。在某些实施方案中，所述
参考量是约500 ng。在一些实施方案中，VLA-4结合抗体是针对VLA-4 的人源化的鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，VLA-4结合抗体是人源化 形式的鼠抗体mAb 21.6。在一些实施方案中，所述VLA-4结合抗体是那 他珠单抗。在某些实施方案中，所述的第一和第二免疫测定是桥连ELISA 测定。在一些实施方案中，所述第一和第二测定包括固定化的未标记 VLA-4结合抗体和可溶性的标记VLA-4结合抗体，其中可溶性的标记 VLA-4结合抗体用酶、荧光标记物、生物素标记物(例如，VLA-4结合抗 体可以净皮生物素化)或者放射性标记物进4亍标记。在一些实施方案中，在 单一反应基底上在平行反应体积中(例如在多孑L板的分离孔中)实施第一 和第二免疫测定。在某些实施方案中，所述生物学样品^L血清样品。在一 些实施方案中，所M象是人患者。在一些实施方案中，患者具有多发性 硬化。在一些实施方案中，患者具有类风湿性关节炎。在某些实施方案中， 所述患者具有克罗恩氏病。
根据本发明的另 一 方面，提供鉴定患有病症的患者对蛋白质治疗剂 的临床显著阈值水平的抗体应答的方法。所述方法包括(a)评价在具 有所述病症并且没有用所述治疗剂治疗的对照患者群体中抗治疗剂抗 体的水平和(b)选择在所述对照群体的抗治疗剂抗体水平之上至少2 倍标准偏差的水平作为具有所述病症并且用所述治疗剂治疗之患者的 抗体应答的临床显著的阈值水平。在一些实施方案中，所述蛋白质治疗 剂是治疗性抗体或者其抗原结合片段。
仍根据本发明的另 一方面，提供鉴定针对治疗性蛋白质具有临床显 著的抗体应答的患者的方法。所述方法包括测定从患有病症并且已施用 所述治疗性蛋白质的患者获得的生物学样品中是否存在有阔值水平的 特异性结合所述治疗性蛋白质的抗体，其中所述阈值水平为在具有所述 病症的未治疗对照患者群体中特异性结合所述治疗性蛋白质的抗体水 平之上至少2倍标准偏差。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质是治 疗性抗体或者其抗原结合片段。因此，本发明的一些方面提供检测对象 中针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的方法，这是通过确定 从已施用VLA-4结合抗体的对象所获得的生物学样品是否含有阈值水 平的结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体，其中存在至少阈值水平的所 述可溶性抗体指示针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。
本发明的每个所述限定可以涵盖本发明的很多不同实施方案。因此，
预期本发明涉及任一要素或者要素组合的每个所述界限可以包括在本 发明的各个方面中。
图1举例说明在免疫测定中游离那他珠单抗的干扰。
图2举例-沈明在封闭测定中游离那他珠单抗的干扰。
图3显示作为在初始施用那他珠单抗之后时间的函数，临床显著的 免疫应答的概率。
图4举例说明阳性免疫应答对复发率的总体影响。P-安慰剂，n =
315。 AN-抗体阴小生，n = 569。 TP--过寸生阳性，n - 19。 PP-持续P曰
性，n = 37。
图5举例说明在初始施用那他珠单抗之后在特定时间间隔期间(A: 0-3个月，B: 3-6个月，C: 6-9个月，和D: 9-12个月)阳性免疫应答 对复发率的影响。P-安慰剂，n = 315。 AN-抗体阴性，n = 569。 TP --过性阳性，n = 19。 PP-持续阳性，n = 37。
发明详细说明
本发明的一部分涉及用于检测和监测针对施用给对象的治疗性蛋白 质(例如，治疗性抗体)的免疫应答的方法、组合物和试剂盒。在一方 面，本发明提供用于鉴定针对治疗性抗体具有临床显著的免疫应答的患 者的方法。根据本发明，除非免疫应答达到临床显著的阈值水平，存在 可检测免疫应答不是临床显著的。例如，在那他珠单抗的临床研究中， 免疫应答的临床显著的阈值水平令人吃惊地是在没有接受该治疗剂的 对象中所观测到的对照免疫应答水平之上超过1.645倍标准偏差(例如， 超过约2倍标准偏差)。
本发明的某些方面涉及用于检测抗净皮施用给对象的治疗性VLA-4 结合抗体的临床显著免疫应答的方法。本发明的一些方面尤其可用于检 测和监测已接受至少一剂量(例如一个治疗剂量)的VLA-4结合抗体 的对象的免疫应答。本发明的一些方面包括鉴定和/或监测对治疗性 VLA-4结合抗体具有临床显著的免疫应答的对象，评价免疫应答，和/ 或基于所述免疫应答的本质和/或程度确定适合的临床治疗(例如，特 定治疗方案)。可以应用关于对象针对施用VLA-4结合抗体的应答的信 息来调整、设计和/或优化对所述对象的治疗方案。因此，本发明的一 个方面涉及鉴定对治疗性VLA-4结合抗体具有临床显著的免疫应答的 对象。本发明的另一方面涉及监测对象针对治疗性VLA-4结合抗体的 免疫应答。本发明进一步的一个方面还涉及基于对象针对治疗性VLA-4 结合抗体的免疫应答来确定适合的治疗策略以治疗某些疾病(例如，多 发性硬化、克罗恩氏病或者类风湿性关节炎等)。
可以应用VLA-4结合抗体治疗许多与炎症有关的疾病和病症。这样 的病症包括，例如中枢神经系统炎症(例如，除多发性硬化外，还有脑 膜炎、视神经脊髓炎、神经性结节病、CNS脉管炎、脑炎和横贯性脊髓 炎)、组织或器官移植排斥或者移植物抗宿主病、急性CNS损伤(例如， 中风或者脊髓损伤)；慢性肾病；变态反应(例如，变应性哮喘)；l型 糖尿病；炎性肠病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)；重症肌无力； 纤维肌痛；关节炎病症(例如，类风湿性关节炎、银屑病关节炎)；炎 性/免疫性皮肤病(例如，银屑病、白癜风、皮炎、扁平苔藓(lichen planus));系统性红斑《良疮；Sjogren综合征；血液性癌症(例如，多 发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤)；实体瘤，比如肉瘤或者癌瘤(例如， 肺癌、乳癌、前列腺癌、脑癌)；和纤维化病症(例如，肺纤维化、骨 髓纤维化、肝硬化、系膜增生性肾小球肾炎、新月体肾小球肾炎、糖尿 病肾病和肾性间质性纤维化)。在一些实施方案中，所述病症是由a4pl 或/和a4p7亚基调节引起的疾病。
在一个实施方案中，VLA-4结合抗体是人源化形式的鼠mAb21.6, 例如那他珠单抗。因此，本发明的一些方面涉及评价对象针对那他珠单 抗的应答和确定对于多发性硬化和可用那他珠单抗治疗的其它炎性病 况或疾病的适合治疗。
本发明的一部分涉及鉴定对象针对VLA-4结合抗体(例如，人源化 形式的鼠mAb21.6，比如那他珠单抗或AN100226)的免疫应答，以及 确定该应答是否具临床显著性。
如本文中使用的，"鉴定"具有免疫应答的对象是指检测或诊断对象 中是否存在免疫应答。因此，鉴定具有临床显著免疫应答的对象是指检 测或者诊断对象中是否存在临床显著的免疫应答。
如本文中使用的，针对治疗性蛋白质的抗体应答的"临床显著的阈
值"为在对照参考水平之上至少2倍标准偏差。在一个实施方案中，针 对治疗性蛋白质的临床显著的免疫应答的阈值水平可以为在对照水平 之上3-6 (例如，约4或5)倍标准偏差之间。所述对照水平可以是， 在接触所述治疗性蛋白质之前患者群体(例如，具有比如多发性硬化、 克罗恩氏病或者类风湿性关节炎疾病或者病况的对象群体)中存在的结 合活性的平均或者中值水平。在一个实施方案中，对于抗那他珠单抗抗 体的临床显著的阈值是500 ng/ml患者血清(例如，在10倍稀释血清的 测定中为50 ng/ml的阈值)。
如本文中使用的，免疫应答是针对治疗性蛋白质的免疫原性应答， 其特征在于对象中一种或多种结合所述蛋白质的抗体的水平增加。因
此，免疫应答的特征可以是诱导识别(例如，特异性识别)和结合所述 蛋白质(例如VLA-4结合抗体，如那他珠单抗)的可溶性抗体的水平 增加。典型的免疫应答是多克隆的并且可以包含对所述治疗性蛋白质具 有不同亲和性(和因此不同程度的特异性)的抗体。因此，本发明的方 法可以包括检测对象中一种或多种诱导抗体的存在，所述抗体结合被施 用给该对象的治疗性蛋白质(例如，VLA-4结合抗体)。在一些实施方 案中，所述诱导抗体可以作为存在于生物学样品(例如，血清样品)中 的可溶性抗体而被检测到。
本发明的一些方面涉及用于检测从患者所得生物学样品中临床显著 的阈值水平的结合活性的测定。所述阈值水平表示低于该水平的任何可 检测结合活性被认为不具有临床显著的水平。如本文中使用的，结合活 性指在生物学样品中检测到的与治疗性蛋白质结合的量。如本文中所描 述的，生物学样品中结合活性的存在可以反映针对施用所述治疗性蛋白 质的多克隆应答。因此，结合量可以反映由对所述蛋白质具有不同亲和 性的不同抗体的结合的合计。在某些实施方案中，对所述结合活性进一 步进行分析以便以更大置信度确定，所述结合水平是由于抗所述治疗性 蛋白质的特异性抗体的存在还是由于其它因素比如类风湿因子。可以在 如本文所述的竟争性测定中评价结合活性的特异性。
在本发明的一个方面中，只有当一个或多个得自对象的样品在本发 明的测定中被检测为阳性时，该对象才被鉴定为阳性(即，对治疗性蛋 白质具有临床显著的免疫应答)。当得自对象的样品包含对治疗性蛋白
质(例如VLA-4结合抗体)的至少临床显著的阈值水平的结合活性时 就被确定为阳性检验结果。令人吃惊地，对治疗性抗体的任何可检测免 疫应答的存在不是临床显著的。根据本发明，基于筛选患者以检测对治 疗性抗体的任何免疫应答水平的方法鉴定了许多假阳性患者，这导致了 不必要的额外临床监测和对无临床显著性免疫应答的患者的潜在焦虑。 例如，当基于对治疗性抗体的免疫应答在未接受所述治疗性抗体对象中 所存在平均结合活性水平之上超过1.645倍标准偏差而将患者鉴定为阳 性时，就检测到过多的假阳性。根据本发明，当釆用1.645倍标准偏差 截断值时，理论上5%的假阳性率是对假阳性数的低估，因为这5%代 表对任何免疫应答的假性检测率并且不是关于临床显著的免疫应答的 假阳性率。令人惊奇地，通过提高该截断水平(水平低于该截断值时， 应答被认为是阴性)至高于对照参考水平之上1.645倍标准偏差，假阳 性数降低，并且不影响对具临床显著的免疫应答的对象的鉴定。应当理 解所述阈值应被设置为可产生对于具临床显著的免疫应答患者的可接 受检测率的水平。因此，即使临床显著的阈值应当被设置在免疫前参考 水平之上超过1.645倍标准偏差，也不应当将该阈值设置得过高以致于 降低真实阳性的检测效率。
在本发明的一个方面中，如果得自对象的样品在本发明的测定中未 检验到阳性，例如，它们没有达到抗体应答的临床显著的阈值水平，则 该对象的免疫应答可以被分类为阴性。相反，如果在单一测定中基于结 合活性的阳性水平(临床显著的阈值水平或者之上的水平)而将对象鉴 定为阳性，所述患者可能是"一过性"或者"持续性"阳性。 一过性阳 性是指在规定时间段中对治疗性抗体具有阳性免疫应答的患者，而在所 述时间段之后该患者变成阴性。相反，持续阳性是指在比规定时间段更 长的时间内临床显著的水平的免疫应答为阳性的患者。应当理解的是， 一过性和持续性是相对性术语。因此，如果在由临床显著的时间段分开 的两个或多个时间点(例如在3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 IO或更长的时间 点)上对于免疫应答而言患者检验为阳性，那么患者就可以初始被分类 为持续性的。然而，如果在随后测定中对于免疫应答而言患者被检验为 阴性，那么所述患者随后就可以被重新分类为一过性的。临床显著的时 间间隔可以是至少一周、 一个月、 一年或者更长时间。例如，阈值时间 间隔可以是在30至180天之间，约60天、约42天等。 一过性免疫应 答的存在可以作为疗效暂时降低的指示。持续性免疫应答的存在可以作
为疗效持续降低的指示。因此， 一过性或持续性免疫应答的存在可以是 临床上相关的，并且可以影响被鉴定为 一过性阳性或者持续阳性之对象 的治疗方案的特点。持续性免疫应答可使调整对象的治疗方案成为必 要。
如本文中所使用的，术语"治疗方案"指对象的治疗过程。治疗方 案可以包括施用药用剂和/或实施治疗。方案的选择可以包括选择剂量、 给药时间安排、给药频率、治疗持续期间、与一种或多种药用剂或疗法 的联合治疗以及由医学和治疗领域的技术人员使用的关于治疗决策的 任何其它方面。治疗方案还可以包括应用疗法比如施用于对象或者由对 象使用的程序或装置以预防或治疗疾病或病症。治疗程序的实例，尽管 没有限制的意图，包括应用医疗设备或者外科手术。因此，确定或者变
更VLA-4结合抗体治疗方案可以包括确定或者变更施用给对象的治疗 性VLA-4结合抗体的剂量、施用频率、施用途径、治疗持续期间(例 如，给药次数)、是否将VLA-4结合抗体治疗与一种或多种另外的治疗 相组合、是否中止VLA-4结合抗体治疗、是否应用不同的VLA-4结合 抗体、和/或是否应用VLA-4结合抗体的联合等。在一个实施方案中， 本发明可以包括确定是否应用VLA-4结合抗体的替代治疗，例如，是 否应用(5干扰素。
本发明的一些方面涉及检测和/或监测人体(如人类患者)中针对 VLA-4结合抗体的免疫应答。因此，如本文中所应用的，对象可以是人 类对象。对象可以是患有炎性疾病或病况的人类患者。对象可以是已接 受至少一剂量VLA-4结合抗体(例如，那他珠单抗)的患者。对象可 以是正应用(或者已应用)VLA-4结合抗体(例如，那他珠单抗)进行 长期治疗的患者。对象可以是正应用(或者已应用)VLA-4结合抗体(例 如，那他珠单抗)进行重复治疗的患者。如本文中应用的，长期治疗可 以包括在一段长时期中(例如，在该时期中来控制或者治疗炎性疾病或 者病况)施用VLA-4结合抗体。相对而言，重复治疗可以包括当必要 时(例如，当它们恶化或者"突发"时治疗炎性疾病的症状)重复应用 VLA-4结合抗体的治疗过程(例如， 一段施用期)。在一个实施方案中， 当对象第一次用治疗性VLA-4结合抗体进行再治疗时，认为患者正接 受重复治疗。本领域技术人员应当理解的是，与用VLA-4结合抗体治 疗相联合或者除此之外分别地，对象还可以经受或者已经受其它疗法或 者程序的治疗。应当理解的是，本发明的各个方面不限于人类对象。因
此，对象可以是非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、 啮齿动物或者其他的非人类对象。
鉴定和监测免疫应答
在一方面，本发明涉及鉴定和/或监测对象中针对VLA-4结合抗体 的免疫应答。在某些实施方案中，通过测定得自对象的生物学样品优选 血中是否存在与如本文所述的施用VLA-4结合抗体相结合的诱导抗体 来实施所述鉴定和/或监测。
在本发明的一个方面中，对得自对象的生物学样品实施定性测定， 如果所述生物学样品含有大于阈值量的抗VLA-4结合抗体的抗体，则 鉴定为存在免疫应答。在一个实施方案中，阈值量是在该值之上时免疫 应答被鉴定为临床相关的量，例如如本文所述确定阈值水平。临床相关 的免疫应答可以具有临床影响，例如，它指示应当评价对象以确定是否 应当调整所施用VLA-4结合抗体的剂量、以确定是否应当监测该患者 的其它生理参数、以确定是否应当实施对于免疫应答的进一步测定、或 者以确定是否应当采取任何替代的或者另外的步骤来治疗或者监测所 述对象等。临床相关的免疫应答可以与 一种或多种其它因素 一起进行评 价。应当理解的是，对临床相关免疫应答进行鉴定本身不要求对对象的 疗法或者治疗方案作出改变。
在本发明的另一方面中，可对生物学样品实施定量测定以确定抗施 用给对象的VLA-4结合抗体的抗体量(例如，抗体效价)。还可以对定 量结果进行分析来确定免疫应答是否是在临床显著的阈值水平之上。
根据本发明，可以通过对在不同时间点上从对象获得的样品进行测 定在一段时间中来评价对象中抗VLA-4结合抗体(例如，那他珠单抗) 的免疫应答。多重评价策略允许监测对象针对VLA-4结合抗体的免疫 应答并且可以允许对治疗性VLA-4结合抗体方案进行个体化调整以适 合对象的治疗需要。例如，可以从对象获取样品，检验有关针对已施用 给对象的VLA-4结合抗体的免疫应答，随后在第二次可以从对象获取 另 一样品并进行相似的检验。通过对于以预定时间间隔的依次测定而在 一段时间中来检测和证实对象样品中抗体应答的存在，允许监测针对治 疗性VLA-4结合抗体治疗的免疫应答。检测和监测针对所施用VLA-4 结合抗体的免疫应答还允许调整对象的总体治疗，例如通过调整(例如，
改变或者暂停)VLA-4结合抗体治疗和/或通过调整另外的治疗(例如， 调节对象免疫应答的治疗)。
可以基于在不同时间从已施用过VLA-4结合抗体的对象获得的至 少两个生物学样品中对针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的 确定来选择或者调整治疗方案。对于对象针对VLA-4结合抗体的临床 显著的免疫应答的确定可以指示起始、继续、调整或者停止给对象施用 特定药用剂和/或治疗是否是有益的。例如，在得自对象的至少两个生 物学样品中对针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的确定，可 以作为改变作为目前治疗方案一部分的施用给对象的药剂剂量的基础。 可以改变治疗从而包括另外的药用剂或治疗或者降低或提高目前所施 用药用剂或治疗的剂量。例如，鉴定对象中针对VLA-4结合抗体的免 疫应答可以提示启动或者继续应用免疫抑制药用剂的治疗等。在一些实 施方案中，可以基于对得自已用VLA-4结合抗体治疗的对象的单个生 物学样品中针对VLA-4结合抗体的初始免疫应答的测定，来选择初始 治疗方案。选择并施用所选治疗方案后，可以对得自对象的一个或多个 随后的生物学样品进行针对VLA-4结合抗体的免疫应答的进一步确定 并且可以提供调整治疗方案的根据。
在不同时间点上从对象获取的一个或多个生物学样品中，可以对针 对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的确定结果进行比较，以评 价或者衡量对象中对VLA-4结合抗体治疗的免疫应答的发生、发展或 者消退。对象中对VLA-4结合抗体的免疫应答的发生，其特征可以是 结合VLA-4结合抗体的至少一种抗体水平的增加，并且可伴随对象中 发生一种或多种生理变化或者症状。针对治疗性VLA-4结合抗体的免 疫应答的发展，其特征可以是结合所述治疗性VLA-4结合抗体的至少 一种抗体水平的进一步增加。然而，免疫应答的发展可以包括至少另外 一种抗体水平的增加，和/或随着免疫应答发生而增加的至少一种抗体 的水平降低。例如，起始免疫应答可以主要是IgM应答。随着免疫应 答的发展，优势抗体可以从IgM转换为IgG抗体。免疫应答的发展还 可以伴随一种或多种起始生理变化或症状的发展(例如，增加、降低或 者调整)或者一种或多种其它生理变化或症状的发生。对象中针对治疗 性VLA-4结合抗体的免疫应答的消退，其特征可以是结合治疗性VLA-4 结合抗体的一种或多种抗体水平的降低。免疫应答的消退还可以伴随有 某些生理变化或者症状的降低。然而，应当理解的是，针对治疗性VLA-4
结合抗体的免疫应答的发生、发展和/或消退，除了抗体水平的可检测 变化外，可以是无临床症状的。
针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的发展和消退通常可 以通过对象样品中结合VLA-4结合抗体的抗体水平分别随时间而增加 或者降低来指示。例如，如果在来自对象的第一样品中确定没有特异性 结合VLA-4结合抗体的抗体、或者确定存在有低于临床显著水平的所 述抗体，并且在来自所述对象的第二或者随后样品中确定存在临床显著 的阈值水平的特异性结合VLA-4结合抗体的抗体，就可以表明在该对 象中发生了针对VLA-4结合抗体的免疫应答。可以通过与在得自所述 对象的初始或者之前的样品相比较，在得自对象的第二或者随后样品中 存在更高水平的特异性结合VLA-4结合抗体的抗体，来指示对象中针 对VLA-4结合抗体的免疫应答的发展。可以通过与在得自所述对象的 初始或者之前的样品相比较，在得自对象的第二或者随后样品中存在更 低水平的特异性结合VLA-4结合抗体的抗体，来指示针对VLA-4结合 抗体的免疫应答的消退。
在本发明的一个方面中，可以基于抗治疗性VLA-4结合抗体的抗体 水平是否在预定的临床显著的阈值之上，将免疫应答归类为阳性或者阴 性。在一些实施方案中，临床显著的阈值是在免疫前对象(即，还没有 接受任何剂量的治疗性VLA-4抗体的对象)中所测量结合活性平均水 平之上超过1.645 (例如，超过2、 3、 4、 5或者6)倍标准偏差。在一 些实施方案中，对象是健康对象，以及在某些实施方案中，对象是有病 的患者(例如，患有多发性硬化、克罗恩氏病或者类风湿性关节炎的患 者)。在一个实施方案中，阈值水平是X).5微克/ml血清。在一些实施方 案中，阈值水平为等于约0.5微克/ml血清。
在一个实施方案中，已施用过VLA-4结合抗体的对象可以被归类而 分为至少三种类别之一。 一种类别，在本文中被称为"阴性"，包括结 合活性处于或者低于临床显著的阈值水平的对象(例如，在得自对象的 生物学样品(例如血清)中未检测到浓度至少约500 ng/ml的针对VLA-4 结合抗体的抗体的对象)。第二类别，在本文中被称为"一过性阳性"， 包括仅在有限次中，例如在l、 2、 3、 4、 5个时间点上(例如，从所述 最后时间点起间隔至少30天的随后时间点上没有检测到针对VLA-4结 合抗体的抗体)检测到结合活性在阈值水平之上的对象。第三类别，在
本文中被称为"持续性阳性"，包括在预定次数中，例如在至少由阈值
时间间隔分开的2、 3、 4、 5、 6、 7或更多时间点上检测到结合活性在 阈值水平之上的对象(例如，在由最小阈值间隔分开的时间点上，在从 对象获取的2、 3、 4、 5、 6、 7或更多个生物学样品中检测到浓度至少 约为500 ng/ml的针对VLA-4结合抗体的抗体的对象)。在一些实施方 案中，所述阈值间隔为至少约10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90 或者更多的天数。"持续性阳性"患者中VLA-4抗体疗法的功效可能有 损失，而对于"一过性阳性"患者却在功效仅仅暂时性降低后完全恢复。
应当理解的是，阴性对象可以变成一过性阳性。并且如果阳性免疫 应答发生并且在规定数的时间点(例如至少两个时间点)上持续，则任 一种对象可能变成持续性阳性。
在一个实施方案中，可以根据对单一阳性结果的确定来改变疗法。 在另一实施方案中，可以根据确定对象为一过性阳性对象来改变疗法。 仍在另一实施方案中，可以根据确定对象为持续性阳性对象来改变疗 法。
如上所论述的，应当理解的是，术语一过性和持续性是相对的术语， 并且看上去为持续阳性的患者可以在以后的时间变为阴性。因此，应当 对阳性应答的患者进行定期监测以评价阳性应答的持续性、治疗的有效 性和/或阳性免疫应答其它临床表现的存在性。
根据本发明，疗效降低的风险(例如，复发的风险)随着阳性免疫 应答持续时间的延长而增加。因此，在本发明的一个方面中，患者检验 为阳性的次数的重要性低于患者保持阳性的时间长度的重要性。在一个 实施方案中，如果在第一次施用治疗性VLA-4结合抗体起3个月内检 测到阳性结果，就可以确定患者具有疗效降低的风险(例如，复发的风 险)。在一个实施方案中，在第一次施用治疗性VLA-4结合抗体之后， 如果阳性免疫应答持续3-6个月这种风险就增加，并且如果阳性免疫应 答持续6-9个月这种风险就进一步增加，并且随着持续9-12个月这种风 险仍将进一步增加。应当理解，如果持续超过一年的话，复发的可能性 甚至会进一步增加。因此，不同的治疗方案可能适合于具有持续阳性免 疫应答的患者。然而，应当理解即使在存在持续阳性免疫应答的情况， 治疗性抗体疗法并不需要中止，除非该疗法变得无效(例如，几乎丧失 所有的疗效)或者引起其它消极的临床表现。在一些实施方案中，如果治疗无效或者在具有低于阈值水平免疫应
答的患者中疗效正在丧失的话可以中止治疗性VLA-4结合抗体的治疗。 在缺少临床显著的免疫应答的情况下，缺乏疗效(或者疗效降低)可能 表明治疗的无效性是由于患者针对治疗剂的免疫应答以外的一种或多 种因素造成的。如果未检测到阳性应答，患者将不是一过性阳性。因此， 可以考虑替代治疗。
应当理解，结合活性或者抗体水平可以与免疫前的活性或者水平 (即，在施用第一剂VLA-4结合抗体之前所测量的)进行比较。然而， 如本文所述，与免疫前的量进行对比并不是必需的，因为当临床显著的 阈值(或者在阈值之上的)量的结合活性或者抗体水平存在于患者样品 中时，就可以鉴定为阳性免疫应答。
测定和检测方法
才艮据本发明的一些方面，测定抗体应答的阈值量。如本文所论述的， 可以实施定性测定。作为替代，可以实施定量测定并且在一个实施方案 中，定量数据可以被解释成定性输出结果(例如，抗体的量是否大于阈 值量)。
可以采用任何适合检测抗体量或者结合活性的方法来确定其是否至 少为阈值量或者活性。检测测定可以包括用于检测、确认、结合、纯化、 去除、定量和/或其它常规检测特异性结合特定治疗性蛋白质(例如， VLA-4结合抗体，或者其片段)的抗体的任何已知免疫检测方法。例如， 免疫检测技术可以包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)(包括但 不限于标准夹心ELISA或者桥连ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免 疫放射测定(immunoradiometric assay )、荧光免疫测定、4t学发光观'J 定、生物发光测定、放射免疫沉淀测定(RIPA)和Western印迹。此 外，免疫检测技术可以包括基于光学传感器的方法，比如表面等离子体 共振(SPR)或者导模共振滤波器(guided mode resonance filter)
(BIND)。尽管本文中提供的某些实施例涉及利用附着于表面的固定化 VLA-4结合抗体的测定(例如ELISA)，本领域的普通技术人员应当认 识到本发明在一些方面可以包括不用VLA-4结合抗体表面附着的测定
(例如，流式细胞仪测定等)。其它的免疫检测技术可以包括免疫放射 测定(IRMA)、时间分辨荧光分析(TRF)或者电化学发光(ECL)。 大量可用的免疫检测方法已经在科学文献中有过描述，比如，例如Doolittle M H和Ben-Zeev 0,1999; Gulbis B和Galand P， 1993; De Jager R et al.， 1993;和Nakamura et al., 1987,其每一篇通过参考并入本文 中。
在一个方面中，实施测定来检测生物学样品中存在针对VLA-4结合 抗体的结合活性。在一个实施方案中，可以通过确定所观测到的结合活 性是否对VLA-4结合抗体具有特异性或者确定这是否是由于生物学样 品中可能存在的千扰因子比如类风湿因子或者其它结合因子造成的，来 评价结合活性的特异性。
本发明的一些方面可以包括涉及将生物学样品与固定化结构接触的 测定法，以固定化存在于生物学样品的任何结合活性。可以应用检测结 构来检测固定化的结合活性。固定和检测结构可以分别是固定化的未标 记的和非固定的标记的如本文所述的VLA-4结合抗体。在一个实施方 案中，固定化结构可以结合于固体基底或者表面(例如，在多孔板的孔 中，在ELISA板的表面上等)。在另一实施方案中，固定化结构可以通 过共价键或者其它连接(例如，固定化结构可以与生物素分子相偶联并 通过生物素-链亲合素相互作用附着于包被有链亲合素的珠)附着于珠 (例如磁性珠)。在一些实施方案中，所述的珠可以附着于表面或者基 质。例如，磁性珠可以被固定在磁性表面上。相似的，带电的珠可以被 固定在带电的表面上(例如，电极)。
如果结合活性(例如，由固定化结构捕获的结合活性的量)的检测 量在预定的阈值之上，就可以确定为阳性结果。可通过在测定中包含竟 争性结构来评价所检测结合活性的特异性。所述竟争性部分可以是所包 含的非固定化的未标记VLA-4结合抗体，用来与所述测定的固定和/或 检测步骤竟争。如果竟争结构的存在使所述结合活性降低了预定的最低 限度百分率或者截断值的话，则确定所述结合活性具有特异性并且确认 为阳性结果。如果竟争结构的存在未能使所述结合活性降低预定的最低 限度百分率或者截断值的话，则确定该结合活性不具有特异性并且同时 确定初始阳性结果对于免疫应答为阴性结果。
根据本发明的一些方面，可以应用预定量的固定、检测和/或竟争结 构。相似地，可以应用包含预定量抗体的样品来确立结合活性的初始阈 值水平，已知所述抗体结合VLA-4结合抗体。例如，可以在测定中应 用10 ng/ml至1000 ng/ml (例如，约50 ng或者约500 ng )的对照抗体
来确立阈值水平。用来确定阈值水平的抗体量将决定所述测定的灵敏 度。通常，可以认为测定的灵敏度与用来确定初始阈值的抗体的量相近。 应当理解，在对照中的结合量可以作为参考用来确定阈值(例如，阈值 量可以是在对照中所获得信号的倍数或者分数)。然而，在一个实施方 案中，在对照测定中获得的信号被用作阈值量。还应当理解的是，有大 量的因素(包括对照抗体的亲和性和特异性)可以影响测定敏感性。
在一个实施方案中，可以通过在测定中掺加一定量的竟争结构来评 价结合活性的特异性，所述量与用来确立结合阈值水平的对照抗体量相
近。例如，测定中可以掺加约10 ng/ml至1000 ng/ml (例如，约50 ng， 或者约500 ng)的未标记可溶性VLA-4结合抗体。不过，可以应用其 它量的竟争结构。
因此，在本发明的一些实施方案中，在对生物学样品第一等分试样 的第一免疫测定中确定生物学样品中针对VLA-4结合抗体的结合活性 的第一水平，并且在对生物学样品第二等分试样的第二免疫测定中确定 针对VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平，其中在第二免疫测定中 掺加比第一免疫测定中更大量的未标记可溶性VLA-4结合抗体，并且 如果结合活性的第一水平大于参考水平以及结合活性的第二水平小于结 合活性第一水平的预定百分率的话，就表明存在至少阈值水平的针对 VLA-4结合抗体的可溶性抗体。
监测已用治疗性抗体比如VLA-4结合抗体治疗的对象中的免疫应答。 例如，如上所述，可以通过应用单一水平"截断值"确定特异性结合 VLA-4结合抗体的抗体量来实施所述评价和/或检测。当处于或者大于 本文所使用的截断值结合水平时，检测增加将被记为显著的和/或阳性 的，并且是对生物学样品中可溶性结合活性水平检测反映样品中特异性 结合VLA-4结合抗体的抗体水平的证实性确定。在另一些实施方案中， 可以定量实施针对治疗性VLA-4结合抗体的免疫应答的鉴定以确定来 自对象的生物学样品中特异性结合VLA-4结合抗体的抗体的效价。
在本发明的一个方面中，免疫检测测定可以是ELISA。正如本领域 普通技术人员所应理解的，术语"ELISA，，涵盖了用于免疫检测的大量 方案。例如，ELISA方法包括夹心ELISA、桥连ELISA等。在本发明 的一些实施方案中，ELISA免疫测定是手动测定。然而，在本发明的一
些实施方案中，所有或部分的ELISA可以以自动方式来实施。
在本发明的一些实施方案中，ELISA测定包括使用VLA-4结合抗 体作为固定化靶结构，其被包被于ELISA板上。随后包被的ELISA板 可以与生物学样品接触用以确定对象抗体的水平，所述抗体特异性结合 VLA-4结合抗体。在本发明的一些实施方案中，应用ELISA测定生物 学样品的第一等分试样用以确定是否存在结合于所述固定化耙VLA-4 结合抗体的阈值量，并且应用ELISA测定相同生物学样品的第二等分 试样以确定结合于固定化靶VLA-4绪合抗体的阈值(或者阈值之上的) 水平是否指示VLA-4结合抗体特异性的抗体。在本发明的一个方面中， 在等分试样中可溶性结合活性的阈值水平是约等于对照或者参照样品 中存在的结合活性水平，其中所述对照或参照样品中包含至少约50 ng/ml、 100ng/ml、 200 ng/ml、 300 ng/ml、 400ng/ml、 500 ng/ml、 600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml或者1000 ng/ml的结合于VLA-4 结合抗体的参照抗体。在一个实施方案中，确定阈值水平为大约等于对 照或者参照样品中结合活性的水平，所述样品中含有约500 ng/ml的结 合于VLA-4结合抗体的参照抗体。所述参照抗体可以是多克隆的或者 单克隆的。所述参照抗体可以是鼠抗-那他珠单抗抗体(例如，在 Sheremata et al.， 1999， Neurology 52， pages 1072-1074中描述的12C4,该 文献通过参考并入本文)。如本文所述，如果结合于固定化乾VLA-4结 合抗体的水平至少为阈值水平，并且可溶性结合活性被确定为是特异性 结合VLA-4结合抗体的抗体的结合活性，那么它就鉴定了对象中针对 VLA-4结合抗体的免疫应答。
通常，可用于本发明方法的ELISA方法可以包括，从已施用治疗性 抗体比如VLA-4结合抗体(例如那他珠单抗等)的对象获取生物学样 品并将该样品的等分试样与固定化抗体相接触。在一些实施方案中，固 定化抗体可以是与施用给对象的抗体相同的VLA-4结合抗体。固定化 抗体捕获样品中与所述抗体结合的分子或者化合物，并且将所述样品与 第二检测结构相接触，所述第二检测结构能够选择性结合或者检测所捕 获的分子或者化合物(例如，标记的第二抗体)。能选择性结合或者检 测所述复合物的结构的实例包括但不限于能用各种标记物(例如，生物 素/亲合素配体结合方案，如本领域所公知的)标记的抗体或者其它配 体。本领域的技术人员还可以应用标记的第三抗体。在一些优选实施方 案中，所述第二结构为所述固定化抗体的标记形式。
在本发明的一些实施方案中，ELISA测定包括，应用治疗性VLA-4 结合抗体作为固定化靶结构，用其包被ELISA板。所包被的ELISA板 随后可以与生物学样品接触用以确定特异性结合治疗性VLA-4结合抗 体的对象抗体的水平。在本发明的一些实施方案中，应用ELISA测定 生物学样品的第一等分试样以确定是否存在针对固定化靶VLA-4结合 抗体的结合活性阈值量，并且应用ELISA测定同一生物学样品的第二 等分试样以确定结合于固定化靶VLA-4结合抗体的阈值(或阈值以上) 水平是否指示VLA-4结合抗体特异性的抗体。在本发明的一个方面中， 等分试样中可溶性结合活性的阈值水平为大约等于对照或者参照样品 中存在的结合活性水平，所述对照或者参照样品包含至少约50ng/ml、 100ng/ml、 200 ng/ml、 300 ng/ml、 400 ng/ml、 500 ng/ml、 600 ng/ml、 700 ng/ml、 800 ng/ml、 900 ng/ml或者1000 ng/ml的结合VLA-4结合 抗体的参照抗体。在一个实施方案中，确定阈值水平为大约等于对照或 者参照样品中的结合活性水平，所述样品包含约500 ng/ml的结合于 VLA-4结合抗体的参照抗体。所述参照抗体可以是多克隆的或者单克隆 的。所述参照抗体可以是鼠抗-那他珠单抗抗体(例如，在Sheremataet al., 1999， Neurology 52， pages 1072中描述的12C4 )。
结合VLA-4结合抗体的参照抗体可以是结合那他珠单抗的参照抗 体(例如，以高亲和性例如纳摩尔级亲和性结合那他珠单抗的抗体)。 在一些实施方案中，结合那他珠单抗的参照抗体可以阻断那他珠单抗结 合VLA-4(例如，它可以将那他珠单抗与VLA-4的结合抑制至少50%、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或者更多)。所述参照抗 体可以是鼠单克隆抗体。所述参照抗体可以是对那他珠单抗有特异性的 抗独特型抗体。在一些实施方案中，所述参照抗体是12C4抗体(可以 从Maine Biotechnology Services, Inc., Portland ME获得；见，命J如 Sheremata et al., 1999, Neurology 52, page 1072 )。 12C4是一种阻断性抗 体，其阻断那他珠单抗结合VLA-4。在一些实施方案中，所述参照抗体 与12C4竟争与那他珠单抗的结合。可以使用评价抗体能力的标准方法 来证明抗体结合的竟争性，所述抗体能力是用来竟争性抑制12C4抗体 阻断那他珠单抗结合VLA-4的能力。在一些实施方案中，应用桥连 ELISA确定是否存在特异性结合VLA-4结合抗体的抗体。在桥连 ELISA中，特异性结合VLA-4结合抗体的抗体(例如，来自生物学样 品)充当包被在ELISA板上的VLA-4结合抗体与溶液中经可检测标记
的VLA-4结合抗体(例如非固定化的)之间的桥。由此，经标准处理 后的ELISA信号表明可检测标记已经被连接于固体相以及在该生物学 样品中存在可溶性结合活性。
将所述生物学样品的等分试样与固定化抗体在有效条件下以及在足
以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的一段时间中相接触通常涉
及，向固定化抗体(例如，固定在ELISA板上的VLA-4结合抗体)加
入生物学样品的等分试样并且孵育该混合物足够长的时间，以使固定化 抗体与存在于生物学样品等分试样中并具有可溶性结合活性的分子或
者化合物形成(即结合)免疫复合物。具有可溶性结合活性的分子或者 化合物可以是特异性结合VLA-4结合抗体的诱导抗体，或者可以是结 合VLA-4结合抗体的非诱导的内源性抗体或受体(例如，类风湿因子 [RF或者抗Fab抗体)。之后，通常清洗该样品抗体混合物(例如，ELISA 板、斑点印迹或者Western印迹)以去除未结合的抗体和/或来自测定 混合物的物质。
如果检测到阈值水平的结合活性，可以实施另外的步骤以确认所述 结合活性是否指示特异性结合治疗性VLA-4结合抗体的诱导抗体。对 于此确认步骤，可以制备生物学样品的第二等分试样，并且除了还要在 测定(例如，ELISA测定)中添加预定量的非固定的未标记竟争性VLA-4 结合抗体以外，根据关于对第一等分试样的描述进行测定。例如，预定
量的竟争性抗体可以是未标记量的抗体，其在对照测定中降低特异性信 号约50%或者更多。如果未标记的VLA-4结合抗体的存在降低信号超 过预期的百分比量，那么所述阈值(或者阈值之上)结合活性就被判断 为是存在特异性结合治疗性VLA-4结合抗体的抗体的阳性指标。相反， 如果未标记VLA-4结合抗体的存在降低信号少于预期的百分比量，那 么阈值(或者阈值之上)结合活性就被判断为对于特异性结合治疗性 VLA-4结合抗体的抗体为阴性。应当理解的是，非特异性信号可以是由 于血清因子所致，而不是结合VLA-4结合抗体的抗体。如本文中使用 的，术语"掺加"(spike， spiked )是指向样品或者测定中添加未标记的 (或者不同标记的)可溶性竟争VLA-4结合抗体。
如本文中使用的，"降低百分率(percentage reduction )，，是在第一 等分试样中所确定之结合水平的百分率。因此，例如，如果在第一等分 试样中指示有约500 ng/ml当量的真有结合活性的分子或者化合物，并
且在第二等分试样中包括未标记的VLA-4结合抗体使信号量降低超过 40-卯％ (例如，约50%或者更多、约55%或者更多、约60%或者更多、 约65%或者更多、约70%或者更多、约75%或者更多、约80%或者更 多、约85%或者更多、约90%或者更多)，那么就认为生物学样品中的 结合活性指示存在特异性结合治疗性VLA-4结合抗体的诱导抗体。但 是如果在第二等分试样中包括未标记的VLA-4结合抗体使信号量降低 小于20-40%，那么就不认为i物学样品中的结合活性指示存在特异性 结合治疗性VLA-4结合抗体的诱导抗体。在一些实施方案中，竟争抗 体可以是可溶性未标记的那他珠单抗。在一些实施方案中，可以以约100 Hg/ml的终浓度使用可溶性未标记的那他珠单抗。然而，如果它导致所 获得信号对于含有对照量的参照抗体的对照样品有预定的下降(例如， 约40%、约50%或者更多)，就可以使用任何浓度的游离未标记的那他 珠单抗。例如，对照样品可以含有约500ng/ml、约3 ng/ml或者任何其 它合适量的参照抗体(例如，12C4)。如本文中所指出的，在得自患者 的生物学样品中存在特异性结合VLA-4结合抗体的抗体，这表明所述 对象具有针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。
在"夹心"ELISA实例中，治疗性VLA-4结合抗体(例如，那他
表面上，比如聚苯乙烯微量滴定板的孔。随后，将来自已至少施用一次 治疗性VLA-4结合抗体(例如那他珠单抗)的对象的样品添加到孔中。 在结合和/或清洗以去除未结合物质之后，可以检测结合于所述耙抗体 的结合分子或者化合物。可以通过添加连接有可检测标记的第二抗体来 完成检测。此外，可以根据上文所述来确认所述结合分子或化合物作为 抗体的身份，所述抗体特异性结合VLA-4结合抗体。
本领域普通技术人员应当理解的是，不管个别特征(例如，本文描 述的确认步骤)， 一般而言，ELISA具有某些共同的特征，比如包被、 孵育和结合、清洗以去除未特异性结合的物质，和检测结合的免疫复合 物。
在用抗原或者抗体包被板时，通常用靼抗体溶液孵育所述板的孔， 保持过夜或者规定的若干小时。包被緩冲液可以是磷酸钠/BSA包被緩 沖液或者另一本领域已知的合适的包被緩冲液。随后，将清洗所述板的 孔以去除不完全吸附的物质。随后用非特异性蛋白质"包被"所述孔的任何剩余的可用表面，所述蛋白质对于测试样品是抗原性中性的
(antigenically neutral )。该蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋 白或者奶粉溶液等。包被允许封闭固定表面上非特异性吸附位点并且由 此降低由于抗血清在所述表面上的非特异性结合引起的背景。
在ELISA中，可以应用第二或者第三检测手段或者可以应用直接检 测手段。当应用第二或者第三检测方法时，在蛋白质或者抗体结合所述 孔之后，用非反应性物质包被以降低背景(例如，用封闭緩冲液比如 Tris-蔗糖封闭緩冲液或者本领域公认的其它封闭緩冲液)，并进行清洗 以去除未结合的物质，使固定表面与待检验的生物学样品在有效允许免 疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。随后，对所述免疫复合物 的检测需要标记的第二结合配体或者抗体，以及第二结合配体或者抗体 连同标记的第三抗体或者第三结合配体。在本发明的一些优选实施方案 中，所迷第二结合配体是VLA-4结合抗体(例如，与用作靶抗体相同 的VLA-4结合抗体)。
如本文所用的，术语"在有效允许免疫复合物形成的条件下"表示 一些条件，其优选包括用溶液来稀释所述抗原和/或抗体，所述溶液比 如BSA、牛y球蛋白(BGG)、磷酸盐緩沖液(PBS) /Tween、含酪蛋 白和Tween 20的PBS或者含Tween 20的PBS/BSA緩冲液。在本发明 的方法中可以应用本领域已知的其它各种测定稀释剂。这些添加剂还倾 向于帮助降低非特异性背景并且可以包含最多0.5M的NaCl。
如本文所用的，"适合的"条件还表示孵育的温度或者持续对间足以 允许有效的结合。孵育步骤通常从约1至2至4小时左右，温度优选25 t:至27"C，或者可以在4X:过夜。在本发明的方法中可以应用本领域已 知的各种测定温度和时间参数。
在ELISA中孵育步骤之后，清洗接触表面以去除未结合的物质。优 选的清洗步骤可包括用溶液比如PBS/Tween、TBS/Tween或硼酸盐緩冲 液进行清洗，所述溶液还可以包含最多0.5MNaCl。在所述测试样品和 所述靶抗体之间形成特异性免疫复合物以及随后的清洗之后，可以确定 甚至微量免疫复合物的存在。应当理解的是，在本发明的方法中，可以 应用>^领域已知的其它的清洗緩冲液配方。
为了提供检测手段，所述第二或者第三抗体将具有相连的可检测标
记。在某些实施方案中，所述可检测标记是酶，其一旦与适宜的发色底 物一起孵育将产生显色。因此，例如，可以在有利于形成进一步免疫复
合物的条件(例如，在室温下，在含PBS溶液比如PBS-Tween中孵育 2小时)下使所述的第一和笫二免疫复合物与偶联脲酶-、葡糖氧化酶-、 碱性磷酸酶-、过氧化氢酶-的抗体或者其它偶联抗体接触或者孵育一段 时间。
本领域技术人员还应当理解的是，在本发明的方法中可以利用一种 或多种阳性和阴性质量控制。阳性质量控制样品可以是正常的血清样 品，其含有预定量的已知结合VLA-4结合抗体的抗体。质量控制样品 可以在测定所述生物学和对照样品的相同条件下并与之平行地进行反 应。阴性质量控制样品可以是已知不包括已知结合VLA-4结合抗体的 抗体的血清样品。本领域的技术人员应知道在ELISA中如何利用阳性 和阴性对照反应以及样品，从而确i人并验证在所述测定中应用的溶液和 /或底物和/或方案的功能。例如，阳性对照可以包括已知量的特异性结 合VLA-4结合抗体的抗体，因此当在与测试样品(例如生物学样品) 同样的条件下处理时，它指示所述测定在预期参数内工作。阴性对照的 实例可以是已知不包含特异性结合VLA-4结合抗体的抗体的样品。当 在与所述测试样品(例如，生物学样品)同样条件下处理这样的阴性对 照时，该阴性对照将指示在生物学样品中检测到的结合是由所述生物学 样品引起的，而不是由于测定成分的污染或者与所述生物学样品无关的 其它因素所造成的。本发明方法涵盖的测定方法的一个非限制性实施例 可以包括以下步骤。用溶于緩沖液的约0.25 ng/mL那他珠单抗参比标 准溶液包被ELISA板的孔并在环境温度下过夜孵育所包被的板；用清 洗緩沖液清洗所述板孔至少一次并用封闭緩冲液在环境温度下孵育所 述板孔最少1小时；在测定稀释剂中以约1:10稀释对照样品和筛选样 品；在所述测定稀释剂中一起稀释竟争性样品和那他珠单抗(约1 mg/mL)，使得那他珠单抗的终浓度为约100 jig/mL以及所述竟争性样 品的最终稀释度约为1:10;在环境温度下孵育对照样品、筛选样品和竟 争样品约1小时并用清洗緩沖液清洗所述板孔至少一次；在环境温度下 孵育所述板孔中的所述样品约60至150分钟并用清洗緩冲液清洗所述 板孔至少三次；添加约100nL/板孔的生物素化-那他珠单抗，该生物素 化-那他珠单抗在测定稀释剂中被稀释到约1:1000,在环境温度下孵育 该板约60-90分钟，并用清洗緩冲液清洗所述板孔至少三次；向板孔中
的样品添加链亲合素-辣根过氧化物酶，其在测定稀释剂中以约1:5000 稀释，在环境温度下孵育该板约60-90分钟，并用清洗緩沖液清洗该板 至少三次；向所述板孔中添加足够量的发色底物以使抗体结合可见，在 环境温度下显影该板几分钟，通过向所述板孔中添加1 N HzS04来停止 显影；以及读取所述板孔，由此获得结果。
本发明还考虑，本文描述的ELISA试剂可以通过商业化生产包装成 试剂盒，以检测在本文所述生物学样品中是否存在特异性结合VLA-4 结合抗体的抗体和/或测量该抗体。
还应理解的是，除了预定的值(比如依照本文描述鉴定的有临床显 著性的阈值，其用于具体的治疗性蛋白质)以外，用于本发明的对照可 以包括，与所述试验材料平行检验的材料的样品。实例包括准备与试验 样品平行检验的阴性对照样品(例如，通过制造产生的)。
如本文所用的，生物学样品可以是但不限于以下任一项对象的体 液，包括血、血清、血浆、尿、唾液、胸腔积液、粪便、滑液、脑脊液、 粘液和组织浸润物。优选的体液包括血、血浆和血清。如本文所用的， 可以应用医学相关领域技术人员众所周知的方法获取生物学样品。可以 直接从对象或者可以从细胞、组织或者其它培养物获取生物学样品。生 物学样品可以是新鲜的或者可以在用于本发明方法之前已被保存在适 宜条件(例如，冷冻、冷藏等)下。
应当理解的是，可以在施用治疗剂之后在不同的时间间隔上从对象 获取生物学样品。然而，治疗剂可以具有特征性体内半衰期，并且在给 对象施用所述治疗剂之后，存在于生物学样品中的游离治疗剂的量通常 将以时间函数的形式降低。在生物样品中存在的游离治疗剂(未标记的 和未固定的)可以干扰本发明的结合和检测反应。因此，应当在治疗剂 施用后尽可能长的时间再获取生物学样品，例如在治疗周期中的"波谷" (trough)。"波谷"表示在治疗周期期间存在于对象中的游离治疗剂的 最低量。例如，在一个治疗剂施用后很长时间以及在随后的治疗剂施用 前不久可以出现波谷。应当理解的是，许多因素可以影响波谷的时间安 排，所述因素包括所施用治疗剂的量、所述治疗剂的半衰期、施用频率 等。例如，每月一次施用VLA-4结合抗体(例如300 mg那他珠单抗) 导致在一次施用后约30天并且紧接在随后施用之前出现波谷。然而， 应当理解的是，如果本发明的测定对生物学样品中治疗剂的存在是相对
不敏感的、或者可以解决生物学样品中游离治疗剂的存在，可以对在治 疗施用后不同时间釆集的多个样品实施本发明的测定法。当比较在不同 时间点采集的不同样品的结合活性水平时，从治疗周期的相似阶段(例 如，在治疔剂施用后的相似时间长度)获得各个样品是尤其重要的，从 而可以不需要对生物学样品中游离治疗剂水平的差异进行修正就可以 解释所获得的结果。
应当理解的是，可以在进行测定前稀释生物学样品(例如，2倍、5 倍、10倍、50倍、100倍，以及包括更高或者更低的倍数或者它们之间 的任何倍数)。在一个实施方案中，可以将包含临床显著的阈值量参照 抗体的参照样品稀释与待检验生物学样品相同的倍数，从而使获得的生 物学样品的信号可以直接与获得的参照样品的信号进行比较。
在本发明的一些实施方案中，应用生物样品的一个或多个等分试样。 如本文所用的，术语"等分试样，，(aliquot)表示生物学样品的一部分。 在一些实施方案中，可以从得自对象的生物学样品取两个或多个等分试 样，并且可以应用本发明的方法检验所述等分试样以确定所述对象中是 否存在针对VLA-4结合抗体的免疫应答。例如，可以从得自对象的生 物学样品取两个基本等同的等分试样，其中所述对象已被施用过VLA-4 结合抗体(例如那他珠单抗)，并且可以在一个等分试样(例如，"第一"
等分试样)中检测并确定可溶性结合活性的水平。另外，可以应用本发 明的方法评价所述的另外等分试样(例如，"第二"等分试样)，从而确 认在第一等分试样中检测的可溶性结合活性是特异性结合VLA-4结合 抗体的抗体，这是因为它们具有共同的样品来源，所以可溶性结合活性 也存在于第二等分试样中。在一些实施方案中，如果在第一等分试样中 存在最小阈值水平的结合并且确定可溶性结合活性是特异性结合 VLA-4结合抗体的抗体的活性，就可以鉴定在该对象中存在针对VLA-4 结合抗体的免疫应答。
VLA-4结合抗体
本发明的一些方面涉及用于鉴定和/或监测针对施用给对象的一种 或多种治疗性VLA-4结合抗体的免疫应答的检测测定法。在本发明的 某些方面中，检测测定法包括固定和检测结构。在一些实施方案中，检 测测定法还可以包括竟争结构。如本文所描述的，可以用固定结构来固 定结合VLA-4结合抗体的诱导抗体(例如血清抗体)。可以用检测结构
来检测所固定的抗体。可以让竟争结构与固定结构和/或检测结构进行 竟争来结合所述诱导抗体，从而确定结合所述诱导抗体的特异性。所述 的固定和检测结构可以独立地结合一种或多种抗体，所述抗体是针对
VLA-4结合抗体的免疫应答的特征。因此，所述的固定和检测结构可以 是施用给对象的同样的VLA-4结合抗体(例如，所述固定结构可以是 施用给对象的治疗性VLA-4结合抗体的固定形式，并且所述检测结构 可以是施用给对象的治疗性VLA-4结合抗体的标记形式)。然而，在另 一些实施方案中，固定和检测结构中每种独立地可以是施用给对象的治 疗性VLA-4结合抗体的变体，只要所述的固定和检测结构以适合的亲 和性结合来检测一种或多种抗治疗性VLA-4结合抗体的诱导抗体(例 如，血清抗体)即可。所述的竟争结构通常是所述固定或者检测结构的 可溶性未标记(或者差异化标记)形式。然而，所述竟争结构可以是所 述固定或者检测结构的变体，只要它足以竟争性结合治疗性VLA-4结 合抗体从而确定测定中所检测的结合活性的特异性即可。
根据本发明的一些方面，可以以治疗目的应用任意一种或多种 VLA-4结合抗体(包括那他珠单抗和/或相关的VLA-4结合抗体)。因 此，可以使用任意一种或多种VLA-4结合抗体作为本发明检测测定法 中的固定、检测和/或竟争结构。在一个实施方案中，VLA-4结合抗体 可以是IgG抗体(例如，IgG4抗体)。在另一实施方案中，VLA-4结合 抗体可以是多克隆的或者单克隆的。仍在另一实施方案中，VLA-4结合 抗体可以是人源化形式的鼠抗体。
例如，在US 5，840，299中描述了那他珠单抗和相关的VLA-4结合抗 体。mAb(单抗)21.6和HPl/2是结合VLA-4的鼠单克隆抗体的实例。 那他珠单抗是鼠mAb 21.6的人源化形式(见，例如，美国专利No. 5,840,299 )。人源化形式的HP 1/2也已描述过(见，例如，美国专利 No. 6,602,503 )。另外几种VLA-4结合单克隆抗体比如HP2/1、 HP2/4、 L25和P4C2也已描述过(例如，见美国专利No. 6,602,503; Sanchez-Madrid et al" 1986 Eur. J. Immunol, 16:1343-1349; Hemler et al., 1987 J. Biol. Chem. 2:11478-11485; Issekutz and Wykretowicz, 1991， J. Immunol, 147: 109 (TA-2 mab); PuUdo et al， 1991 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245;和美国专利No. 5,888,507)。 i午多可用的VLA-4 结合抗体与细胞(例如淋巴细胞)上的VLA-4相互作用，但不引起细 胞聚集。然而，已观察到另一些抗-VLA-4结合抗体引起这样的聚集。 HPl/2不引起细胞聚集。HPl/2 MAb ( Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol., 16:1343-1349 )有极高的效能，阻断VLA-4与VCAM1和 纤连蛋白的相互作用，并且对VLA-4的表位B具有特异性。该抗体和 其它的B表位特异性抗体(比如Bl或者B2表位结合抗体；Pulido et al.， 1991 J. Biol. Chem.， 266(16):10241-10245 )代表一类可用的VLA画4结合 抗体。
示例性VLA-4结合抗体具有一个或多个CDR，例如，本文所公开 特定抗体的所有三种HC CDR和/或所有三种LC CDR，或者与这种抗 体(例如那他珠单抗)总计有至少80、 85、 90、 92、 94、 95、 96、 97、 98或99% —致性的CDR。在一个实施方案中，HI和H2超变环 (hypervariable loop )具有与本文所迷抗体的那些HI和H2超变环一 样的规范(canonical)结构。在一个实施方案中，LI和L2超变环具有 与本文所述抗体的那些LI和L2超变环一样的规范结构。
在一个实施方案中，HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列与 本文所述抗体(例如那他珠单抗)的HC和/或LC可变结构域的氨基酸 序列有至少70、 80、 85、卯、92、 95、 97、 98、 99或者100%—致性。 所述HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列可以与本文所述抗体 (例如，那他珠单抗)的相应序列具有至少一个氨基酸、但不超过IO、 8、 6、 5、 4、 3或2个氨基酸的差异。例如，所述差异可以主要或者全 部在框架区中。
所述HC和LC可变结构域序列的氨基酸序列可以由在高严谨条件
下与另外序列杂交的序列来编码，所述另外序列是本文所述的核酸序列 或者编码本文所述氨基酸序列的核酸或者编码其可变结构域的核酸序
列。在一个实施方案中，所述HC和/或LC可变结构域的一个或多个框 架区(例如，FR1、 FR2、 FR3和/或FR4)的氨基酸序列与本文所述抗 体的HC和LC可变结构域的相应4匡架区有至少70、 80、 85、 90、 92、 95、 97、 98、 99或者100%的一致性。在一个实施方案中， 一种或多种 重链或轻链框架区(例如，HC FR1、 FR2和FR3)与来自人生殖系抗 体的相应框架区的序列具有至少70、 80、 85、卯、95、 96、 97、 98或 者100%的一致性。
计算两个序列间的"同源性"或者"序列一致性"(所述术语可以在 本文中互换使用)依照以下各项实施。为最优比较目的来比对所述序列(例如，为了最优比对可以向第一和第二氨基酸或者核酸序列之一或者 两者中引入间隙，并且为了比对目的可以忽略非同源性序列)。应用
GCG软件包中的GAP程序确定最优比对的最佳得分，所述程序具有 Blossum 62评分矩阵，其中间隙罚12分，间隙扩展罚4分和移码间隙 罚5分。随后比较氨基酸残基或者在相应氨基酸位置的核苷酸或者核苷 酸位置。当笫一序列中的位置由第二序列中相应位置上的相同氨基酸残 基或者核苷酸所占据时，那么在该位置上所述分子是一致的(本文应用 的氨基酸或者核酸"一致性"等同于氨基酸或者核酸"同源性")。两个 序列间的一致性百分率是所述序列共享的一致性位置数目的函数。
技术人员应意识到，在VLA-4结合抗体中可发生保守性氨基酸替 换，从而提供所述抗体的功能等同的变体，即，所述变体保留了 VLA-4 多肽的功能性。如本文所用的，"保守性氨基酸替换"是指不改变发生 氨基酸替换的蛋白质中相对电荷或者大小特性的氨基酸替换。可以根据 本领域技术人员公知的改变多肽序列的方法来制备变体，比如这些方法 汇编在文献中,例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook， et al" eds.， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989，或者Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel， et al" eds., John Wiley & Sons, Inc., New York。 VLA-4结合抗体的示例性功能等同变体包括在本文所^>开 蛋白质的氨基酸序列中的保守性氨基酸替换。氨基酸的保守性替换包括 在以下组之内的氨基酸中发生的替换(a) M、 I、 L、 V; (b) F、 Y、 W; (c) K、 R、 H; (d) A、 G; (e) S、 T; (f) Q、 N;和(g) E、 D。
如本文所用的，术语"在高严谨条件下杂交"描述用于杂交和清洗 的条件。实施杂交反应的指导可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)， 6.3.1-6.3.6中找到，其通过参 考并入本文。在该文献中描述了水性和非水性的方法，可以应用其任一 种方法。高严谨杂交条件包括在约45C在6xSSC中杂交，然后在65 C在0.2xSSC、 0.1% SDS中清洗一或多次，或者基本相似的条件。
可以检验抗体的功能特性，例如VLA-4结合性，例如，根据美国专 利No. 6,602,503的描述。
抗体生成
可以通过免疫法产生结合VLA-4的抗体，例如，利用动物。可以利 用VLA-4的全部或者部分作为免疫原。例如，可以用a-4亚基的细胞 外区域作为免疫原。在一个实施方案中，被免疫的动物含有产生免疫球 蛋白的细胞，所述细胞具有天然的、人的或者部分人的免疫球蛋白基因 座。在一个实施方案中，所述非人动物包括至少一部分的人免疫球蛋白 基因。例如，能够工程化改造小鼠抗体生成有缺陷的小鼠品系，使其具 有大片段的人Ig基因座。应用杂交瘤技术，可以产生并选择具有期望 特异性的源于所述基因的抗原特异性单克隆抗体。见，例如， XenoMouseTM， Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994),美国7>开专利 申请No. 2003-0070185、美国专利No. 5,789,650和WO 96/34096。例如， 还可以在啮齿动物中产生针对VLA-4的非人抗体。非人抗体可以被人源 化，例如，描述于美国专利No. 6,602,503、 EP 239 400、美国专利No. 5,693,761和美国专利No. 6,407,213。
EP 239 400 ( Winter et al.)描述了通过用 一个物种替换另 一物种互 补决定区(CDR)(在指定可变区域内)来改变抗体。预计CDR替换的 抗体与真正的嵌合抗体相比有更少可能在人中引起免疫应答，因为所述
CDR替换的抗体包含相当少的非人成分(Riechmann et al., 1988, Nature 332， 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239， 1534-1536 )。典型地，通 过应用重组核酸技术将鼠抗体的CDR替换为人抗体的相应区域，从而 产生编码期望替换抗体的序列。可以添加期望亚型的人恒定区基因片段 (通常对CH为和对CL为k )并且在哺乳动物细胞中共表达人源化 重链和轻链基因，从而产生可溶性人源化抗体。
Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA. Dec;86(24): 10029-33 和WO 90/07861已描述了一种方法，其包括通过计算机分析针对与来 源鼠抗体V区框架的最优蛋白质序列同源性来选择人V框架区，并建 立鼠V区的三级结构模型从而显现可能与鼠CDR相互作用的框架氨基 酸残基。随后，将这些鼠氨基酸残基叠加在同源的人框架之上。还可参 见美国专利No. 5,693,762; 5,693,761; 5，585，089和5，530，101。 Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271 )利用对于CDR移植分别源于 NEWM和REI重链和轻链的V区框架作为标准，而没有大量引入小鼠 残基。应用Tempest et al.,的方法构建基于NEWM和REI的人源化抗 体的优点是，通过x射线晶体学已经知道NEWM和REI可变区的三维 结构并且由此可以对CDR和V区框架残基之间的特异性相互作用建立 模型。
可以修饰非人抗体以包括在特定位置插入人免疫球蛋白序列(例如 共有人氨基酸残基)的替换，所述特定位置例如以下一个或多个位置(优
选至少五个、十个、十二个或者全部)(在轻链可变结构域的FR中) 4L、 35L、 36L、 38L、 43L、 44L、 58L、 46L、 62L、 63L、 64L、 65L、 66L、 67L、 68L、 69L、 70L、 71L、 73L、 85L、 87L、 98L、和/或(在重链可变 结构域的FR中)2H、 4H、 24H、 36H、 37H、 39H、 43H、 45H、 49H、 58H、 60H、 67H、 68H、 69H、 70H、 73H、 74H、 75H、 78H、 91H、 92H、 93H、和/或103H (根据Kabat编号方式))的取代。例如，见美国专利 No. 6,407,213。
正如对于本领域技术人员是显而易见的，本发明还提供F(ab，)2、 Fab、 Fv和Fd片段；嵌合抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或 CDR2和/或轻链CDR3区已被同源的人或者非人序列所替代；嵌合 F(ab，)2片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3 区已被同源的人或者非人序列所替代；嵌合Fab片段抗体，其中FR和
替代；和嵌合Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区已被 同源的人或者非人序列所替代。
在某些实施方案中，VLA-4结合抗体可以是VLA-4单链抗体、单 结构域抗体或者NanobodyTM。这些抗体类型中每一种的特性以及它们 的应用方法在本领域中是众所周知的。Nanobodies 是抗体的最小功能 性片段并且是源于天然的单链抗体(见Ablynx， Belgium; ablvnx.com )。 NanobodyTM技术是根据以下发现发展而来的，camelidae (骆駝camels 和骆驼llamas )拥有独特的缺少轻链的全功能抗体的储库(repertoire )。 NanobodyTM结构由单可变结构域(VHH )、铰链区和两个恒定结构域 (CH2和CH3)组成。克隆的和分离的VHH结构域是稳定的多肽，其 拥有原始重链的全部抗原结合能力。Nanobody 将常规抗体的特性和 小分子药物的特性结合在一起。Nanobody 显示出高靶向特异性和低 自身毒性。另外，NanobodyTM是非常稳定的，可以通过注射以外的手 段施用，并且易于制造。在某些实施方案中，治疗性VLA-4结合抗体、 固定结构和/或检测结构可以是人源化Nanobody1
TM
可以应用，例如，体外致敏的人脾细胞来产生结合VLA-4的完全人 单克隆抗体，如Boerner et al" 1991, J. Immunol" 147, 86-95描述的。 它们可以通过全功能克隆(repertoire cloning )来制备，如Persson et al" 1991， Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436或者Huang and Stollar， 1991， J. Immunol. Methods 141， 227-236. US 5，798，230描述的。还可以 应用大的非免疫人噬菌体展示文库分离高亲和性抗体，应用标准噬菌体 技术可以将所述抗体开发为人治疗剂(见，例如，Vaughan et al, 1996 Nat Biotechnol. Mar;14(3):309-14; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:l-20;和Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8;美国公开专利申请No. 2003-0232333 )。可以在原核细胞和^ 核细胞中生产抗体。在一个实施方案中，在酵母细胞比如毕赤酵母属 (见，例如，Powersetal. (2001) J Immunol Methods. 251:123-35)、汉 逊酵母属或者酵母属(Saccharomyces )细胞中表达所述抗体(例如， scFv)。在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中生产抗体，尤其是全长 抗体，例如IgG。用于重組表达的典型哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠 卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr- CHO细胞，见Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220，与DHFR选择标记一 起使用，例如，见Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 )、 淋巴细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、K562 和来自转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞 是乳腺上皮细胞。
除了编码免疫球蛋白结构域的核酸序列之外，重组表达载体可以 携带有其它序列，比如调节所述载体在宿主细胞中复制的序列(例如复 制起点)和选择标记基因。所述的选择标记基因帮助选择已引入载体的 宿主细胞(见，例如，美国专利No. 4,399,216、 4,634,665和5,179,017 )。 选择标记基因的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲 氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
在用于抗体(例如，全长抗体或者其抗原结合部分)重组表达的 实例系统中，通过磷酸锔介导转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表 达载体引入dhfr- CHO细胞。在重组表达载体内，抗体的重链和轻链基 因分别可操作性连接至增强子/启动子调节元件(例如，源于SV40、 CMV、腺病毒等，比如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或者SV40 增强子/AdMLP启动子调节元件)以驱动高水平的基因转录。重组表达
载体还携带DHFR基因，其允许应用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已转染 了所述载体的CHO细胞。培养选择的转化宿主细胞以允许表达抗体重 链和轻链并且从培养基中收集完整抗体。应用标准的分子生物学技术制 备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养 基收集抗体。例如，可以通过应用蛋白质A或者蛋白质G的亲和层析 来分离一些抗体。US 6,602,503也描述了表达和纯化VLA-4结合抗体的 典型方法。
抗体还可以包括修饰，例如，改变Fc功能的修饰，例如从而降 低或者消除与Fc受体、或者与Clq或者与两者的相互作用。例如，人 IgGl恒定区可以在一个或多个残基上被突变，例如残基234和237的 一个或多个，例如，根据美国专利No.5,648，260的编号方式。其它示例 性^"饰包括在美国专利No.5，648,260中描述的那些4务饰。
对于包括Fc结构域的一些抗体，可以设计抗体生产系统以合成 Fc区被糖基化的抗体。例如IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中297 位天冬酰胺被糖基化。该天冬酰胺是用双触角型寡糖修饰的位点。该糖 基化参与由Fc/受体和补体Clq介导的效应子功能(Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76)。可以在哺乳动物表达系统中生产所述Fc结构域，所述表达 系统适当地将对应天冬酰胺297的残基糖基化。所述Fc结构域还可以 包括其它的真核翻译后修饰。
还可以通过转基因动物产生抗体。例如，美国专利No,5,849，992 描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建转基因使之包 括乳特异性启动子和编码目标抗体的核酸以及用于分泌的信号序列。由
这样的转基因哺乳动物的雌性动物产生的乳包含分泌于其中的目标抗 体。可以从乳中纯化所述抗体，或者对于一些应用来说，可以直接使用。
如本文所用的，本发明的VLA-4结合抗体可以是基本全长的 VLA-4结合抗体或者其功能片段。例如，如果VLA-4结合抗体的片段 足以允许特异性结合VLA-4结合抗体的抗体与其特异性结合的话，它 就是功能性VLA-4结合抗体并且可以用于本发明的方法和试剂盒。本 领域的技术人员应能够仅应用常规方法和结合测定来鉴定VLA-4结合 抗体片段以及确定VLA-4结合抗体片段是否是功能性VLA-4结合抗体 片段。因此，在本文中提供的对应用固定和非固定化VLA-4结合抗体 的方法的描述和实施例，还将适用于应用功能性固定和非固定化的
VIA-4结合抗体片段。 标i己和检测
本发明的一些方面包括应用非固定的、抗治疗性蛋白质抗体(例 如，VLA-4结合抗体)作为检测结构来评价结合固定化抗治疗性蛋白质 (例如，靶VLA-4结合抗体)的抗体的可溶性结合活性的存在和/或水 平。评价可溶性结合活性存在和/或水平的方法可以包括应用一种或多 种标记的检测结构(例如，包含有或者附着于检测标记的VLA-4结合 抗体)。检测标记净皮定义为可以应用测定法检测的任何结构。本发明的 抗体和功能性抗体片段可以根据标准偶联方法被偶联于用于检测结合 的特异性标记剂。可以应用许多种检测标记，比如提供直接检测(例如， 放射性标记、荧光团[例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP) 等、发色团、光学或者电子致密标记等)或者间接检测(例如，酶标 签比如辣根过氧化物酶)的那些标记。已被附着于或者掺入抗体的检测 标记的非限制性实例包括酶、放射性标记、荧光标记、磷光分子、化 学发光分子、发色团、发冷光分子、光亲和性分子(photoaffinity molecules)和有色颗粒或者配体比如生物素等。此外，本发明的检测方 法可以包括电化学发光方法(electrochemihiminescen ) ( ECL )。
可以应用许多方法检测标i己，这取决于所述标记和其它测定成分 的性质。可以通过光学或者电子密度、放射性发射、非放射性能量转移 等直接检测标记，或者用抗体偶联物、链亲合素-生物素偶联物等间接 检测标记。其它许多可检测标记在本领域中是已知的，将它们附着于抗 体的方法也是如此。
本发明的标记抗体可以是用于体外的抗体，例如，用于免疫测定 比如ELISA中。这些可检测的标记抗体可以是已掺入检测标记的抗体 或者可以是连接至第二结合配体和/或酶(酶标签)的抗体， 一旦与发 色底物接触时所述酶将生成有色产物。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷 酸酶、(辣根)过氧化氢酶或者葡糖氧化酶。优选的第二结合配体是生 物素和/或亲合素和链亲合素化合物。这些标记的应用对于本领域的技 术人员是公知的并且被描述于，例如，美国专利No. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3，996，345; 4，277，437; 4,275,149和4,366,241;其每一篇通过参考 并入本文。
将抗体附着于或者偶联于其检测标记的各种方法在本领域中是 公知的。附着方法可以包括将金属螯合复合物附着于抗体，其中应用例
如有机螯合剂比如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA);亚乙基三胺四乙酸； N誦氯-对-甲苯磺酰胺；和/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲-3 (美国专利No. 4，472，509和4，938，948,其每一篇通过参考并入本文)。单克隆抗体还可以 在偶联剂(比如戊二醛或者高碘酸盐)存在条件下与酶反应。在这些偶联 剂存在的条件下或者通过与异硫氰酸反应可以用荧光标记来标记抗体。在 另一些实施方案中，可以通过衍生化作用，应用不改变抗体识别位点的反 应条件，例如在抗体Fc区中选择性引入巯基基团，来标记抗体。
在本发明测定法中对检测标记的检测在本文中还被称为检测"信 号"。在免疫测定中检测信号的方法在本领域中是众所周知的。在本发 明的一些重要实施方案中，可以应用多孔板读取器(例如，微板读取器) 检测所述测定信号来评价信号的量和/或位置。信号检测可以是光学检 测或者其它适于检测用于本发明的检测标记的检测手段。检测标记的其 它方法在本领域中是众所周知的并且可用于本发明的方法。本发明的方 法包括ELISA，其对检测特异性结合VLA-4结合抗体的抗体有敏感性， 其中该敏感性为至少约1000 ng、 500 ng或者50ng。在一些优选实施方 案中，检测特异性结合VLA-4结合抗体的抗体的ELISA敏感性是至少 约500 ng。
通常，通过施用许多方法可以实现对免疫复合物形成的检测。这 些方法通常基于对标记(label)或者标志物(marker)的检测，比如任 何的放射性、荧光性、生物性和酶标签。关于应用这些标记的美国专利 包括美国专利No. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4，275，149和4,366,241,其每一篇通过参考并入本文。当然，通过应用第二 结合配体比如第二抗体和/或生物素/亲合素配体结合方案可以发现额外的 优点，这是本领域中所知的。
应当理解的是，可以应用在本文中描述的用来获得和产生VLA-4 结合抗体(例如那他珠单抗)的技术来获得和产生以高亲和性结合 VLA-4结合抗体的参考抗体(例如，高亲和性那他珠单抗结合抗体(例 如，12C4"。
试剂盒
本发明的一部分还涉及测定样品中是否存在针对VLA-4结合抗 体的免疫应答的试剂盒。所迷试剂盒的实例可以包括上述抗体，包括但 不限于那他珠单抗或者其它的VLA-4结合抗体，或者其片段。试剂盒 可以包括可检测标记的和/或未标记的抗体并且可以包括用于检测性标 记抗体的溶液和化合物。本发明的试剂盒还可以包括一种或多种以下組 分板、移液器、小瓶、检测标记、溶液(例如，封闭緩冲液、清洗緩 沖液、结合溶液、稀释溶液等)、阳性和/或阴性对照样品和溶液。本发 明的试剂盒还可以包括用于应用试剂盒鉴定生物学样品中针对VLA-4 结合抗体的免疫应答的书面使用说明。本发明的试剂盒还可以包括用于 实施阳性和/或阴性ELISA对照测定的其它组分。本发明的试剂盒还可 以包含用于本发明方法的装备，比如读板器和/或自动仪器。
实施例
实施例1:那他珠单抗免疫原性测定
测定形式和i殳计基于桥连酶联免疫吸附测定(ELISA)。应用适 于桥连测定的标准试剂和方法。简单地说，应用标准方法将那他珠单抗 吸附于微滴定板的表面，随后通过封闭步骤使血清抗体的非特异性结合 最小化。稀释对照和样品并加到孔中。应用标准方法，通过将板和生物 素-那他珠单抗一起孵育，之后与链亲合素-碱性磷酸酶(SA-AP) —起 孵育来完成对结合的抗那他珠单抗抗体的检测。显色程度与结合的抗那 他珠单抗抗体的量成比例。
在板包被緩沖液中将那他珠单抗稀释到特定的浓度，在环境温度 下将其孵育在96孔微滴定ELISA板中过夜。推荐的体积是100 nl/孔。 用清洗緩冲液清洗该板，随后在环境温度下用封闭緩冲液孵育超过l小 时。封闭緩沖液的体积是200 nl/孔。用清洗緩冲液清洗该板，并随后用 在测定稀释剂(添加或者没有添加那他珠单抗(100 ng/ml终浓度))中 稀释为1:10的质量控制和对象(患者)样品在环境温度下孵育2小时±15 分钟。包含添加那他珠单抗的测定稀释剂代表确认步骤。测定稀释剂的 体积是100fil/孔。接下来在清洗緩冲液中清洗所述板，随后在环境温度 下与SA-AP —起孵育30-35分钟。与SA-AP —起觯育的体积是100 p1/ 孔。接下来在清洗緩冲液中清洗该板，随后在环境温度下与AP底物、 磷酸对硝基苯酯(PNPP ) —起孵育45-50分钟。在AP底物中孵育的体 积是100 nl/孔。随后直接向底物反应混合物添加终止溶液(例如H2S04
等)并在405 nm处读取光密度(OC )。
为了使测定可以接受，阳性和阴性对照必须提供在预定值和精度 之内的结果。对于评价对象(患者)样品的结果来说，如果它们的OD 值落在规定的阴性截断质量控制样品之下，那么就判断所述样品为阴 性。如果它们的OD值位于规定的阴性截断质量控制样品之上并且在确 认步骤中由于添加那他珠单抗而引起的对象(患者)样品信号的抑制小 于预定百分率的话，也判断样品为阴性。如果它们的OD值位于规定的 阴性截断质量控制样品之上并且在确认步骤中由于添加那他珠单抗而
引起的对象(患者)样品的抑制大于或者等于预定百分率的话，就判断 样品为阳性。
实施例2:筛选测定针对VLA-4抗体的免疫应答
对来自对象的样品实施筛选测定(如上所述)，所述对象已施用 了那他珠单抗。在已施用了那他珠单抗的患者中检测是否存在针对 VLA-4抗体的免疫应答。
对来自已施用那他珠单抗的对象的生物学样品，应用实施例1中 描述的方法，检验特异性结合那他珠单抗的可溶性抗体的存在。
所迷检验包括应用高亲和性mAb (单抗)作为阳性对照。该高 亲和性mAb检测存在于来自对象的生物学样品中的结合抗体(例如， 结合那他珠单抗的抗体)。确定阴性截断水平为返回可接受准确度/精密 度(25%/25%)的最低浓度；在10%血清中为50ng/mL。在原(未稀 释)血清中，所述mAb的敏感性是500ng/mL。对于敏感性，所述mAb 被确定为检测抗-那他珠单抗的抗体，但是对不相关的人单克隆抗体不 敏感。样品中其它分子或者组分对所述mAb的干扰被确定为包括在 mAb:药物比率大于1:2时游离药物引起的干扰。图l举例说明了游离那 他珠单抗干扰抗-那他珠单抗抗体免疫测定的影响。还发现类风湿因子 也干扰该测定。
除了在实施例1和2中描述的筛选测定，还实施了用来评价所述 筛选测定中结合的表征测定。应用流式细胞术阻断测定，对来自已施用 那他珠单抗的对象的生物学样品，检验其中特异性结合那他珠单抗的可 溶性抗体的存在。应用高亲和性mAb作为阳性对照。所述测定检测阻
断性抗体。关于所用mAb的阴性截断水平被确定为在从未给药患者获 取的血清中平均测量水平之上3-4倍标准偏差。有5%的假阳性率并且 测定敏感性为500 ng/ml的原血清。检验所述mAb的特异性并且所述 mAb被确定为检测抗-那他珠单抗的抗体，但是发现对不相关的人单克 隆抗体不敏感。还检测了游离药物对测定的干扰。所述测定显示存在游
离药物的千扰。由于游离药物引起的阻断测定千扰的评价结果显示在图 2中。
^于萃他珠卓拔^胆辨洒Ot 潜果
比较所述的筛选和阻断测定的阳性结果。有217个阻断测定阳性 和222个筛选测定阳性，因此有5%的差异和98%的一致性。因此，所 述薛选测定提供对象针对治疗性VLA-4结合抗体的免疫应答的准确测 量。
实施例3
对来自已施用那他珠单抗的625名对象的样品实施筛选测定(如 实施例1和2中描述)。在已施用那他珠单抗的患者中检测针对VLA-4 抗体的免疫应答的存在。在患者中检测到针对那他珠单抗的抗体的发生 率是91% ( 569名患者)抗体阴性和9% ( 56名患者)"结合抗体" 阳性，并且在任何时间点上具有3% (19名患者)"一过性"阳性和6% (37名患者)"持续"阳性。所述一过性阳性患者在单个时间点上具有 可检测抗体(浓度为>0.5吗/ml)，但是在其它所有时间点上为抗体阴性。 所述持续阳性患者在两个或者多个时间点上(所述时间点至少间隔42 天)或者在没有跟踪样品检验的单个时间点上具有可检测抗体。
图3显示产生任何抗体的患者中第一阳性结果的时间。6%的患 者产生了针对那他珠单抗的"持续"抗体。在第12周时，超过卯％的 最初持续阳性患者具有可检测抗体。在第36周后没有对象变为持续抗 体阳性。在第12周时， 一过性阳性患者具有可检测抗体，但是随后变 为抗体阴性。
分析这些结果以确定在治疗患者中抗体对原发病症复发率的影 响。图4举例说明抗体对复发率的总体影响。还评价了对象从施用那他 珠单抗起复发时间的影响。图5A-D分别描述了在0-3个月、3-6个月、 6-9个月和9-12个月时的复发率。
潜果
这些结果表明在治疗最开始的3个月期间，没有明显的抗体影响。 从3-6个月，"一过性"抗体阳性患者显示那他珠单抗治疗功效的降低。 "持续"抗体阳性患者显示丧失了那他珠单抗治疗的很多功效。从6-12 个月，在"一过性"抗体阳性患者中功效完全恢复，但是在"持续"抗 体阳性患者中没有。因此，鉴定一过性抗体阳性患者作为继续VLA-4 结合抗体治疗的靶群体是重要的。
等同物
本领域的技术人员应当承认，或者能够确定，针对本发明具体实 施方案的许多等同物仅需要常规试验。这样的等同物也被涵盖于以下的 权利要求中。
本文公开的所有参考文献，包括专利文件，都以整体通过参考并 入本文。如果有抵触的话，将以本申请包括本文中任何定义为准。
已使用的术语和表述被用作说明性术语，但没有限制的意思，并且 没有应用这些术语和表述而排除所显示和描述的任何等同物或者其部分 的意思，应承i人在本发明范围内可以进行各种改进和变化。
权利要求
1.一种检测对象中针对VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答的方法，该方法包括确定来自已施用VLA-4结合抗体的对象的生物学样品是否包含临床显著的阈值水平的可溶性抗体，该可溶性抗体结合VLA-4结合抗体，其中至少阈值水平的所述可溶性抗体的存在指示对所述VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。
2. 根据权利要求1的方法，其中由在从不同时间点上采自所述对 象的至少两个生物学样品中存在至少阈值水平的针对VLA-4结合抗体 的可溶性抗体来指示针对所述VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述时间点分开至少一个月。
4. 根据权利要求2的方法，其中至少阈值水平的结合VLA-4结合 抗体的可溶性抗体存在于在两个连续时间点上采自对象的两个生物学 样品中。
5. 根据权利要求l的方法，其中通过以下步骤确定结合VLA-4结 合抗体的可溶性抗体的水平在所述生物学样品的第一等分试样中确定针对所述VLA-4结合抗体的 可溶性结合活性的水平；和确定所述可溶性结合活性是否对所述VLA-4结合抗体有特异性。
6. 根据权利要求5的方法，其中在所述生物学样品的第二等分试 样中确定所述可溶性结合活性的特异性。
7. 才艮据权利要求1的方法，其中通过以下来确定在所述生物学样 品中结合所述VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平比较在存在两个 或多个不同量的未标记VLA-4结合抗体条件下测量的针对标记VLA-4 结合抗体的结合活性的水平。
8. 4艮据权利要求1的方法，其中通过以下来确定在所述生物学样 品中结合所述VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平比较在存在两个 或多个不同量的可溶性VLA-4结合抗体条件下测量的针对固定化 VLA-4结合抗体的结合活性的水平。
9. 根据权利要求7的方法，其中将在存在第一量未标记VLA-4条 件下测量的针对标记VLA-4结合抗体的结合活性的第一水平与在存在 第二量未标记VLA-4结合抗体条件下测量的针对标记VLA-4结合抗体 的结合活性的第二水平进行比较。
10. 根据权利要求9的方法，其中在所述生物学样品的第一和第二 等分试样中确定所述结合活性的第一和第二水平。
11. 根据权利要求1的方法，其中应用桥连ELISA测定法确定针 对VLA-4结合抗体的可溶性抗体的量。
12. 根据权利要求l的方法，其中在对于所述生物学样品第一等分 试样的第一免疫测定中确定针对VLA-4结合抗体的结合活性的第一水 平，并且在对于所述生物学样品笫二等分试<样的第二免疫测定中确定针 对VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平，其中向所述第二免疫测定 掺加比所述第一免疫测定更多量的未标记可溶性VLA-4结合抗体，并 且其中如果所述第一水平的结合活性大于参考水平并且所述第二水平 的结合活性小于所述第一水平的结合活性的预定百分率的话，就表明在 所述生物学样品中存在至少阈值水平的针对VLA-4结合抗体的可溶性 抗体。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述参考水平是对参考量的针 对VLA-4结合抗体的可溶性抗体所测量的结合活性的水平。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述参考量是约500 ng/ml。
15. 根据权利要求1或12的方法，其中所述VLA-4结合抗体是针 对VLA-4的人源化鼠单克隆抗体。
16. 根据权利要求15的方法，其中所述VLA-4结合抗体是人源化 形式的鼠抗体mAb21.6。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述VLA-4结合抗体是那他珠 单抗。
18. 根据权利要求12的方法，其中所述第一和第二免疫测定是桥 连ELISA测定。
19. 根据权利要求12的方法，其中所述第一和第二测定包括固定 化的未标记VLA-4结合抗体和可溶性的标记VLA-4结合抗体，其中所 述可溶性的标记VLA-4结合抗体用酶、荧光标记或者放射性标记进行 标记。
20. 根据权利要求18或19的方法，其中在单个反应基底上在平行 反应体积中实施所述第一和第二免疫测定。
21. 根据权利要求1或12的方法，其中所述生物学样品是血清样
22. 根据权利要求1或12的方法，其中所述对象是人患者。
23. 根据权利要求22的方法，其中所述患者具有多发性硬化。
24. 根据权利要求22的方法，其中所述患者具有类风湿性关节炎。
25. 根据权利要求22的方法，其中所述患者具有克罗恩氏病。
26. 根据权利要求2的方法，其中从对象获取所述至少两个或多个 生物学样品的时间点,皮分开至少15天、30天、45天或者60天。
27. 根据权利要求2的方法，其还包括，如果在来自所述对象的所 述至少两个生物学样品中确定了结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的 阈值水平，则选择针对所述对象的治疗方案。
28. 根据权利要求27的方法，其中选择治疗方案包括，评价所述 对象的当前疗法，确定针对该对象的新疗法，修改该对象的当前疗法， 或者停止该对象的当前疗法。
29. 根据权利要求28的方法，其中当前疗法包括向所述对象施用 VLA誦4结合抗体。
30. —种选择针对对象的治疗方案的方法，其包括测定已施用VLA-4结合抗体的对象在第一和第二时间点上是否存在针对 VLA-4结合抗体的阳性免疫应答，基于第一和第二时间点的测定结果选择 针对所M象的治疗方案，其中由在一个时间点从对象获得的生物学样品中存在至少临床显著的阈 值量的结合活性来指示在所述时间点上存在阳性免疫应答。
31. 根据权利要求30的方法，其中所述第一和第二时间点分开临 床显著的一段时间。
32. 根据权利要求31的方法，其中所述临床显著的一段时间是至 少30天。
33. 根据权利要求30的方法，其中如果在所述第二时间点检测到 阴性免疫应答，就继续VLA-4结合抗体治疗。
34. 根据权利要求30的方法，其中如果在第一和第二时间点都检 测到阳性免疫应答，就选择不同于VLA-4结合抗体治疗的疗法。
35. 根据权利要求30的方法，其中所述对象具有多发性硬化。
36. 根据权利要求30的方法，其中所述对象具有克罗恩氏病。
37. 根据权利要求30的方法，其中所述对象具有类风湿性关节炎。
38. —种选择针对对象的治疗方案的方法，其包括，从对象获得的至少两个生物学样品中检测是否存在针对VLA-4结合抗体 的临床显著的免疫应答，其中所述对象已施用了 VLA-4结合抗体并且是在 分开至少临床显著的时间间隔的不同时间点上从所述对象获得所述至少 两个生物学样品，以及基于对所述至少两个生物学样品的时间处所iW象 中针对VLA-4抗体的临床显著的免疫应答的检测来选择治疗方案。
39. 根据权利要求38的方法，其中将从所述对象获取样品的时间 分开的临床显著的间隔为至少15天、30天、45天或者60天。
40. 根据权利要求38的方法，其中选择治疗方案包括，评价所述 对象的当前疗法，确定针对该对象的新疗法，修改该对象的当前疗法， 或者停止该对象的当前疗法。
41. 才艮据权利要求40的方法，其中当前疗法包括向所述对象施用 VLA國4抗体。
42. 根据权利要求38的方法，其中检测是否存在针对VLA-4结合 抗体的临床显著的免疫应答包括，确定来自已施用VLA-4结合抗体的对象的生物学样品是否包含阈值水 平的结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体，其中至少阈值水平的所述可 溶性抗体的存在指示针对所述VLA-4结合抗体的临床显著的免疫应答。
43. 根据权利要求42的方法，其中至少阈值水平的结合VLA-4结 合抗体的可溶性抗体存在于在两个连续时间点上采自所述对象的两个 生物学样品中。
44. 根据权利要求43的方法，其中通过以下步骤确定结合VLA-4 结合抗体的可溶性抗体的水平在所述生物学样品的第一等分试样中确定针对VLA-4结合抗体的可溶 性结合活性的水平；并且确定所述可溶性结合活性是否对VLA-4结合抗体有特异性。
45. 根据权利要求44的方法，其中在所述生物学样品的第二等分 试样中确定所述可溶性结合活性的特异性。
46. 根据权利要求42的方法，其中通过以下来确定在所述生物学 样品中结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平比较在存在两个或 多个不同量的未标记VLA-4结合抗体条件下测量的针对标记VLA-4结 合抗体的结合活性的水平。
47. 根据权利要求42的方法，其中通过以下来确定在所述生物学 样品中结合VLA-4结合抗体的可溶性抗体的水平比较在存在两个或 多个不同量的可溶性VLA-4结合抗体条件下测量的针对固定化VLA-4 结合抗体的结合活性的水平。
48. 根据权利要求47的方法，其中将在存在第一量未标记VLA-4 条件下测量的针对标记VLA-4结合抗体的结合活性的第一水平与在存 在第二量未标记VLA-4结合抗体条件下测量的针对标记VLA-4结合抗 体的结合活性的第二水平进行比较。
49. 根据权利要求48的方法，其中在所述生物学样品的第一和第二等分试样中确定结合活性的第一和第二水平。
50. 根据权利要求42的方法，其中应用桥连ELISA测定法确定针 对VLA-4结合抗体的可溶性抗体的量。
51. 根据权利要求42的方法，其中在对于所述生物学样品第一等 分试样的第一免疫测定中确定针对VLA-4结合抗体的结合活性的第一 水平，并且在对于所述生物学样品第二等分试样的第二免疫测定中确定 针对VLA-4结合抗体的结合活性的第二水平，其中向所述第二免疫测 定掺加比所述第一免疫测定更多量的未标记可溶性VLA-4结合抗体， 并且其中如果所述第一水平的结合活性大于参考水平并且所述第二水 平的结合活性小于所述第一水平的结合活性的预定百分率的话，就表明 在所述生物学样品中存在至少阔值水平的针对VLA-4结合抗体的可溶 性抗体。
52. 根据权利要求51的方法，其中所述参考水平是对参考量的针 对VLA-4结合抗体的可溶性抗体测量的结合活性的水平。
53. 根据权利要求52的方法，
54. 根据权利要求38的方法， 的人源化鼠单克隆抗体。
55. 4艮据权利要求54的方法， 形式的鼠抗体mAb21.6。
56. 根据权利要求55的方法, 单抗。其中所述参考量是约500 ng。 其中VLA-4结合抗体是针对VLA-4其中所述VLA-4结合抗体是人源化其中所述VLA-4结合抗体是那他珠
57. 根据权利要求51的方法，其中所述第一和第二免疫测定是桥 连ELISA测定。
58. 根据权利要求51的方法，其中所述第一和第二测定包括固定 化的未标记VLA-4结合抗体和可溶性的标记VLA-4结合抗体，其中所 述可溶性的标记VLA-4结合抗体用酶、荧光标记或者放射性标记进行 标记。
59. 根据权利要求57或58的方法，其中在单个反应基底上在平行 反应体积中实施所述第一和第二免疫测定。
60.根据权利要求38的方法，其中所述生物学样品是血清样品。
61.根据权利要求38的方法，其中所述对象是人患者。
62.才艮据权利要求61的方法，其中所述患者具有多发性硬化。
63.才艮据权利要求61的方法，其中所述患者具有类风湿性关节炎。
64.根据权利要求61的方法，其中所述患者具有克罗恩氏病。
65.一种鉴定患病患者针对蛋白质治疗剂的临床显著阈值水平的抗体应答的方法，该方法包括评价在患所述病并且没有用所述治疗剂治疗的对照患者群体中抗治疗 剂抗体的水平；和选择在所述对照群体的抗治疗剂抗体水平之上至少2倍标准偏差的水平 作为具有所述病症并且用所述治疗剂治疗之患者的抗体应答的临床显 著的阈值水平。
66. 根据权利要求65的方法，其中所述蛋白质治疗剂是治疗性抗 体或者其抗原结合片段。
67. —种鉴定针对治疗性蛋白质具有临床显著的抗体应答的患者的 方法，该方法包括，在从患病并且已施用所述治疗性蛋白质的患者获得 的生物学样品中测定是否存在阔值水平的特异性结合所述治疗性蛋白 质的抗体，其中所述阔值水平为在具有所述病症的未治疗对照患者群体 中特异性结合所述治疗性蛋白质的抗体水平之上至少2倍标准偏差。
68. 根据权利要求67的方法，其中所述治疗性蛋白质是治疗性抗 体或者其抗原结合片段。
69. 根据权利要求l的方法，其中所述方法包括以下步骤 用那他珠单抗包被测定孔；在分开的测定孔中孵育对照样品、筛选样品和竟争样品；. 向测定孔中的样品添加生物素化的那他珠单抗；和应用辣根过氧化物酶测定来检测生物素化的那他珠单抗。
70. 根据权利要求69的方法，其中应用0.25 fig/ml浓度的那他珠 单抗包被所述测定孔。
71. 根据权利要求69的方法，其中所述竟争样品包含终浓度约100 Hg/ml的未标记可溶性那他珠单抗。
全文摘要
本发明涉及在用治疗性蛋白质治疗的对象中鉴定临床显著的免疫应答的方法和产品。本发明的第一方面涉及在用治疗量的VLA-4结合抗体(例如那他珠单抗)治疗的患者中鉴定临床显著的免疫应答的方法和组合物。本发明的第二方面涉及收集用于确定抗所述治疗性蛋白质的抗体效价的样品的以时间发生顺序排列的细节，例如在两个不同的时间点上收集至少两个样品。本发明的第三方面涉及选择关键的阈值水平，其对应于未治疗患者的增加所述对照抗体效价标准偏差两倍的抗体效价。
文档编号G01N33/68GK101351710SQ200680019422
公开日2009年1月21日 申请日期2006年4月4日 优先权日2005年4月4日
发明者埃里克·瓦克休尔, 弗兰塞斯·林恩, 拉克希米·阿马拉瓦迪, 朱利耶·伊丽莎白·泰勒, 米纳·苏布拉马亚姆, 罗宾·麦克戴德·巴尔布尔, 迈克尔·潘扎拉 申请人:生物基因Idec Ma公司;艾兰制药公司