结合层及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：结合层及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明总体上涉及用于生物测定和生物传感器的结合层和基质。
背景技术：
：人们已经开发了生物传感器来检测包括寡核苷酸在内的各种生物分子复合物、抗体-抗原的相互作用、激素-受体的相互作用以及酶-底物的相互作用。通常来说，生物传感器由两个部件构成高特异性的识别元件和将分子识别结果转化为可量化的信号的转换器。这种信号的转化可以通过许多方法来完成，包括荧光法、干涉测量法和重量测量法。直接法不需要使用荧光化合物对待分析物进行标记，由于采用该方法分析相对简便，并且可以研究小分子与不易被标记的蛋白质之间的相互作用，因此令人感兴趣。直接光学法包括表面等离子体共振法(SPR)、光栅耦合器法、椭圆偏振测量法、倏逝波装置法和反射测定法。这些检测方法的理论上预测的检测限已经得到确定并经过试验证实可以用于检测相关的浓度范围。在对生物分子复合物或相互作用进行实时研究时，通常使被固定的(例如，通过化学结合层而连接在传感器芯片表面上的)配体分子与待分析物分子接触。由此使它们发生相互作用，并通过一种或多种上述的检测方法来监测该相互作用。由于这种研究的效率主要取决于配体分子，因此能够有效地使配体分子得到固定通常是基本的和最关键的要求。配体分子的密度高可以使与其反应的待分析物分子的数量增加，从而可以提供一种具有更低检测限的更灵敏的测定方法。除了被固定的配体的量以外，另一个重要的方面是配体在连接到传感器芯片表面上后仍然保持其生物活性。保持高的配体活性就可以保证大量的待分析物分子能够与配体发生相互作用，从而获得更灵敏的分析。配体活性强烈地取决于结合层的生物相容性，以及固定方法和固定过程中的各种参数。在研究大分子(例如蛋白质)与小分子之间的相互作用时，特别需要对分析的灵敏度进行改善，然而由于蛋白质配体与小的待分析物分子之间尺寸的差别，导致所得到的信号可能相对较弱。这种生物测定在药物发现领域中具有特殊的重要性，在该领域中经常对小的靶分子在大的蛋白质类受体上的结合情况进行测定。一种用于将配体分子连接到传感器芯片表面上的最为人们接受的方法是基于使用含有羧基(CG)的结合层的方法，其中所述羧基以酸的形式和/或相应的羧酸盐的形式存在。所述羧基(CG)通常被活化从而形成具有反应活性的酯，然后该具有反应活性的酯与配体分子的亲核性基团反应(主要与伯胺基反应)从而形成酰胺共价键。最通常使用的活化溶液为由水溶性的碳二亚胺的混合物所构成的溶液，最常使用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，来形成具有反应活性的NHS酯。欧洲专利No.1343010教导了一种可供选择的、不常用的方法，其中使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺(硫代NHS)代替NHS。在各种类型的这样的结合层中，市售可得的生物传感器中经常使用的层为基于羧甲基葡聚糖(CMD)的层，例如专利文献No.WO09221976和US5436161中所教导的羧甲基葡聚糖的层，以及科技文献例如J.Chem.Soc.Chem.Commun.1990,1526-1528禾卩Anal.Biochem.1991,198，268-277中所描述的羧甲基葡聚糖的层。据报道，使用标准活化溶液最多可以将这种层中的30n/。-40。/。的羧基活化为NHS酯。另外，已经表明，CMD层通常只结合部分量的蛋白质，这些蛋白质通过静电作用而被吸附到CMD层上。在某些情况中，对于要分析相互作用的测试来说，这种结合能力实际上是不够的。从另一个方面来看，已经证实，由于存在没有被活化的羧基，所以活化后的层带有净量的负的静电电荷。已经知道，在经过常规的灭活步骤(其中活性基团与乙醇胺反应从而形成中性的酰胺)后依然残留有这种电荷。正如本领域技术人员所了解的那样，由于带电荷的待分析物分子可能与该层发生非特异性地相互作用，从而可能导致分析结果被干扰和失真，所以在相互作用分析阶段中不期望在结合层中残留有电荷。可以通过直接偶联法使配体分子更有效地结合，或者可供选择的是，通过使用化学或生物捕获用结构部分(moiety)(例如，生物素或亲和素、抗体、用于硫醇偶联的二硫化物等)使配体分子更有效地结合，例如BiosensorBioelec.1995,10,813-822中所教导的那样。当使用这样的结构部分时，由于结合有更多量的捕获分子，因此预计该层更适合进行更充分地活化。此外，在经过灭活过程后，可以更有效地使这种经过改善后的层中的残留电荷的量达到最少，从而获得对于相互作用分析阶段来说更为有利的环境。因此，人们需要更利于进行活化的经改善的层，因为它们具有更有效地结合配体分子的潜力，因而增加了分析灵敏度并降低了检测限。发明概述根据本发明，提供经改善的结合层，与已知的和目前使用的基质相比，该结合层在用于生物测定和生物传感器方面具有明显的优点。本发明的新颖的层通常包含被至少一个羧酸(有机基团-COOH)或其衍生物取代的多糖，所述羧酸或其衍生物的a-原子上连有氢原子或碳基团，即所述羧基的每个P-原子都是氢原子或碳原子。在本文中这种羧基称作"容易被活化的羧基"。这些羧基在暴露于标准活化溶液(例如，含有N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的标准活化溶液)时易于高效地进行活化。如下文中所示，在使用常规的已有的层时通常最多只有30%-40%的羧基被活化的条件下，使用本发明的所述层时至少有50%的所述容易被活化的羧基被活化，用于与胺进行偶联。因此，这些层能够更加高效地结合配体分子。例如，当在(M立具有氧(在oc-碳上连接有RO-基团)的羧基(如现有技术的层中的羧基)被转化为所述容易被活化的羧基时，抗体的结合密度翻倍。更令人吃惊的是，发现经改善的层不但可以更加高效地结合配体，而且还表现出更高的配体活性，从而获得更灵敏的分析。此外，经过随后进行的活化和灭活工序，可以有效地使本发明所提供的层中的静电电荷的量达到最少。经证实，可以采用一种方法使含有所述容易被活化的羧基的层被中和，而该方法对类似的含有常规的羧基(即在a-碳上连接有取代的氧的羧基)的层几乎没有作用。因此，本发明的第一方面提供一种结合层，其包含被至少一个羧基或其衍生物取代的多糖，其中所述羧基或其衍生物的每个(3-原子都是氢原子或碳原子，并且其中多个所述羧基或其衍生物中的至少一部分被活化，用于与配体分子结合。如本文中所限定的那样，在一个实施方案中，所述结合层包含被至少一个羧酸基团取代的多糖。在另一个实施方案中，所述结合层包含被至少一个羧酸衍生物取代的多糖。在又一个实施方案中，所述结合层包含被羧酸基团和其衍生物的混合物所取代的多糖。该混合物可以是任意比例的，例如比例分别为l:l、1:100、1:1000的混合物或者该比例反过来的混合物，或者是具有任意中间比例的混合物。在再一个实施方案中，羧基或其衍生物彼此独立地通过碳原子数为1至20的连接分子而结合到多糖上，对所述连接分子进行选择从而使得不会对本发明的结合层的结构特性、化学特性或者物理特性产生影响。这种连接分子的非限定性的例子为线性碳链、寡(乙二醇)链或肽链。所述连接分子的碳原子数优选为2或3。本发明的另一方面提供一种制备包含至少一个羧基或其衍生物的结合层的方法，所述至少一个羧基或其衍生物中的每一个(3-原子都是氢原子或碳原子，所述方法包括如下步骤提供具有表面的基底；将多糖固定在所述基底的表面上；将所述多糖进行化学改性，从而形成由所述多糖伸展出来的多个羧基，其中所述羧基的每个(3-原子都是氢原子或碳原子；以及使所述羧基的至少一部分被活化，用于与配体分子结合，其中所述化学改性步骤和所述活化步骤彼此独立，并可以在所述固定步骤之前、所述固定步骤进行过程中或者在所述固定步骤之后进行。在一个实施方案中，该方法进一步还包括使活化后的羧基灭活的步骤。本发明的又一个方面提供一种分析配体与待分析物分子之间相互作用的分析方法，该方法包括如下步骤制备本文中详述的结合层；将至少一个能够与至少一个待分析物分子产生相互作用的配体分子结合到所述层上；使所述配体分子与所述待分析物分子反应，从而使它们之间产生相互作用；以及分析所述的相互作用。在本发明的内容中，术语"结合层"是指包含多糖的层，其中通过直接化学取代法或通过间接改性法，以使得所得到的涂层适合于结合分子这样的方式将所述多糖固定或者偶联到固体基底上。术语"基底"通常是指固体基底，其可以是具有表面的任何基底，其中所述表面适于生物测定或用作生物传感器中的传感元件。所述基底可以由各种材料构成，例如玻璃、塑料或者具有自由电子的金属(例如铜、银、铝和金)的表面；所述传感器表面本质上也可以是亲脂性的，例如该传感器表面含有碳原子数为12至24的垸基链(例如十八烷基胺)。术语"传感元件"是指任何基底,该基底本身或者通过与其它手段相结合而对受检测的待分析物的存在情况、数量或者化学或物理状态是敏感的。该传感元件的例子可以是棱镜、电极、光栅等。可以通过本领域技术人员已知的任意的固定方法将涂层附着到基底的表面上。本文中所使用的术语"固定"或语言上的其任何变通形式是指通过任何化学的、物理的或者机械的结合力或方法将所述涂层的一种或多种成分固着在基底的表面上。优选的是，所述固定方法产生共价键连接。术语"多糖"是指由多于约IO个的单糖残基通过糖苷键彼此连接而构成的任何聚合物。在本发明的范围内，该术语也指未彼此连接在一起的多个单糖或寡糖单元，它们结合到固体基底的表面上，进而形成连续的多糖拼接物(polysaccharideassembly)的层。多糖或其拼接物可以由相同的单糖残基构成，也可以由不同的单糖残基或由单糖残基的衍生物构成。可用于本发明的示例性的多糖包括葡聚糖、类肝素、肝素、透明质酸、海藻酸、琼脂糖、鹿角菜胶、果胶、支链淀粉、直链淀粉、糖原、淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖和各种硫酸酯化的多糖(例如硫酸类肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素或硫酸角质素)。术语"羧基"或语言上的其任何变通形式是指羧酸结构部分(-COOH)或者其任意金属(例如钠、钾、镁等)或非金属(例如铵阳离子等)盐的相应的羧酸根离子。可任选的是，该羧基连接到碳原子数为1至20的连接分子上；优选的是，所述羧基连接到碳原子数为2至3的连接分子上。术语"羧基衍生物"或语言上的其任何变通形式是指直接衍生自羧基的任何官能团，例如酯、酰胺、酸酐、醛或酰卤(例如酰氯、酰溴)。所述羧基衍生物优选为酯，更优选为NHS酯或硫代NHS酯，甚至更优选为硫代NHS酯。未取代的或者化学取代的羧基或其衍生物从多糖中伸展出来，以使得这些基团可以进一步被改性。在本发明的范围内，术语"改性"或语言上的其任何变通形式是指可以引起多糖的化学结构发生变化的任何类型的改变，或者将任何基团结合到多糖的化学结构上而引起的改变。所述改性可以通过本领域技术人员已知的任何方法来完成。优选的是，所述改性的结果直接导致产生多个从多糖中伸展出来的羧基。然而，这样的结果也可以通过两个或多个可以得到最终所需结构的步骤来完成。应当注意的是，由于多糖或其拼接物的尺寸的原因，固定后在基底的表面上可能会存在一些挤在一起的或者不可用的羧酸基团。因此，"从多糖中伸展出来的羧基"这一表达方式或语言上的其任何变通形式是指结合到多糖上(即取代在多糖上)的、并可用于进一步改性的羧基。这种取代本质上可以是化学取代的，可以通过共价键、离子键或任何其它类型的键来进行取代。优选的是，所述化学取代是通过共价键来进行的。在一个实施方案中，化学改性的步骤包括使具有(3-氧原子的至少一个羧基或其衍生物进一步进行化学反应。例如，这种反应可以是利用P-丙氨酸或其任意的衍生物使所述基团或其衍生物发生酰胺化。术语"多个羧基"是指一群结合到多糖上的所述基团，在所使用的用于分析配体与待分析物分子之间的相互作用的分析方法中，所述群的大小应该能够有效地产生可测定的信号。术语"多个…中的至少一部分"是指所述群中的一部分，优选其中至少10%至100°/。的羧基被活化，或基本上被全部活化。更优选的是，所述羧基的群中至少20%的羧基被活化、或30%的羧基被活化、或40%的羧基被活化，或者最优选的是，至少50%的羧基被活化。术语"被活化，用于与配体分子结合"或语言上的其任何变通形式是指，通过直接进行化学反应或生物反应，形成能够结合配体分子的结构部分。(例如)在胺与具有反应活性的酯、酸酐或酰卤偶联的情况中，被活化的基团可以含有离去基团。所述被活化的基团可以进一步含有通过各种机理形成共价键的结构部分，例如用于结合硫醇基的二硫化物或马来酰亚胺结构部分，或者用于醛基偶联的胺结构部分。被活化的基团还可以进一步含有与配体形成非共价键相互作用的结构部分，例如与亲和素形成非共价键相互作用的生物素结构部分，或者与生物素形成非共价键相互作用的亲和素结构部分；被活化的基团的另一个例子是用于捕获重组标记蛋白质的金属螯合剂，例如用于捕获组氨酸标记的蛋白质的次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)。本文中所述的这些结构部分属于本发明的所述羧基的衍生物的范围。术语"配体分子"是指这样的分子，它们能够以生物学方式或非生物学方式通过可逆的或不可逆的相互作用与另外一种分子产生相互作用，并且该相互作用是可以被检测的，即，可以被鉴定、分析和定量。例如，这种配体分子为核酸、肽、蛋白质、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(例如F(ab)、F(ab')2和Fv片段)、聚糖、小的有机分子、细胞、病毒、细菌或生物样品。通常对所述配体分子进行选择以便使得其可以与加到基底的涂敷表面上的待分析物(即，配偶体)特异性地结合。例如，如果配体分子是抗体，那么与其结合的配偶体(即待分析物)为特定的抗原，抗体与特定的抗原特异性地结合。在本发明的范围内，术语"待分析物"或语言上的其任何变通形式是指需要进行化学分析的物质，即分析其与配体分子相互作用的存在情况、对相互作用需要进行定量或者进行动力学或热力学分析的物质。所述待分析物通常为结合到本发明的结合层上的配体的结合性配偶体。例如，预被测定的待分析物可以是核酸、肽、蛋白质、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、聚糖、小的有机分子和其它物质。优选的是，这种预被分析的配体-待分析物间的相互作用为抗体-抗原间的相互作用、蛋白质-蛋白质间的相互作用(例如酶-抑制剂蛋白间的相互作用)和蛋白质-小分子间的相互作用。两个能相互结合的配偶体(即配体与待分析物)之间的相互作用可以使用本领域技术人员已知的任何方法来进行检测。这样的方法可以基于所使用的荧光法、核学法、磁学法、电化学法或光学法。优选的是，所使用的方法为光学法，例如表面等离子体共振法(SPR)。容易被活化的羧基可以是多糖或者多糖的构成嵌段(单糖、寡糖)上原有的羧基，也可以是通过本领域技术人员已知的任何化学改性方法而在多糖或者多糖的构成嵌段上进行取代而形成的羧基。关于将各种基团转化为羧酸基团的方法，例如参见ComprehensiveOrganicFunctionalGroupTransformation,Katritzky,Ed,1995。如上文中所述，容易被活化的羧基的优点来自在oc-碳上发生的氢和/或碳基团的取代。换句话说，每个P-原子都是氢原子或碳原子。正如本领域技术人员已知的那样，a-碳是指连有官能团的碳，在本发明中，a-碳是指连有羧基结构部分的碳。P-原子是直接与a-碳连接的原子。因此，在这样的情况中羧基可以表示为具有通式R^2R3C-COOH的化合物，其中Ri至R3为氢或碳基团。a-碳可以是立体的，即可以是手性的，并以一种立体异构体或者另一种立体异构体的形式存在；或者以两种异构体的混合物的形式(外消旋体或其中一种过量)存在，或者可以从环状或大环主链结构中伸展出来。在本发明的范围内，术语"(x-碳"仅仅是指与末端羧基相连的cc位的碳原子，该末端羧基用于活化并最终与配体分子结合。如果a-碳是spS杂化的，其可以被一个氢和两个碳基团取代、也可以被两个氢和一个碳基团取代、或被三个碳基团取代。如果a-碳是sp2杂化的，其可以被成对的氢或成对的碳基团以及与(5-碳连接的双键以顺式构型或反式构型的形式所取代。在a-碳是sp杂化的情况中，a-碳被与卩-碳连接的三键所取代。羧基可以通过a-碳或通过任何其它原子而连入到多糖结构中。如下文所证实的那样，相对于常规使用的含有具有吸电子基团(例如与OC-碳连接的RO-)的羧基的基质而言，基于含有容易被活化的羧基的多糖的结合层具有明显的优点。附图简要说明为了理解本发明并看清楚其在实际中是如何进行的，现在仅通过非限定性的例子，并参照附图来说明优选的实施方案，其中图1为现有技术的步骤的示意性图，其中通过釆用EDC/NHS(X=H)或硫代NHS(X-SCV)进行活化，从而将配体分子固定到含有羧酸的结合层上。Z型线表示结合层的主体，并不表示羧基在没有任何连接分子的条件下直接结合到所述层上。图2A-2E是示出各种含有羧酸的多糖的结构的图图2A为羧甲基葡聚糖；图2B为海藻酸；图2C为羧甲基纤维素；图2D为果胶；图2E为透明质酸。图3A-3B是示出两种示例性的含有羧酸的合成聚合物通式的图，其中n是表示重复单元数量的整数。图4是示出根据本发明用于将P-氧取代的羧酸转化为容易被活化的卩-碳取代的羧酸的示例性方法的图。该例子中使用的P-丙氨酸乙酯被认为是该方法的一个实施方案。图5是示意性示出根据本发明采用EDC/硫代NHS进行活化，从而将配体分子高效地固定到具有容易被活化的基团的结合层上的方法的图。参见下文的发明详述和用于示意性比较的图1中所示出的将配体分子固定到现有技术的结合层上的方法。图6示出了两幅6个不同浓度的(i-内酰胺酶蛋白TEMl的突变体与其抑制剂蛋白BLIP之间相互作用的传感图。图6A示出了在使用NHS进行活化的条件下的反应的传感图，图6B示出了在使用硫代NHS进行活化的条件下的反应的传感图。图7是示意性示出在活化和随后的灭活过程中使用二胺分子使电荷最小化的图。需要注意的是，为了在灭活后获得不带有负电荷的层，至少50。/。的羧基应当被NHS(X=H)或硫代NHS(X=S03')活化。发明详述本文中所公开的发明的独特性在于发展了具有结合层的SPR生物传感器，所述结合层以最佳方式在保持配体活性的同时，通过获得高密度的配体而可以提高分析灵敏度。在研究的过程中，对现有技术中的层以及活化方法的局限性进行了多次观察。当采用EDC和NHS的标准溶液对基于常规的多糖一羧甲基葡聚糖(CMD)的层进行活化时，通常只有相当少的一部分的被吸附到接近表面处的生物分子才真正地连接到所述层上。可以猜测的是，这样的活化程度对于更有效的偶联来说是不够的。对其它多糖(例如海藻酸或羧甲基纤维素)的情况也进行了类似的观察(参见实施例1和2)。令人感兴趣的是，合成的聚合物(例如聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸))表现出更加有效的活化作用和随后的固定作用。但是，配体分子表现出低的活性，可能是由于这些聚合物具有较低的生物相容性(参见实施例1至4)。现巳证实，多糖(例如CMD、海藻酸和羧甲基纤维素)和其它市售可得的含有羧基结构部分的多糖(例如透明质酸和果胶)的活化作用降低可能源自它们的共同结构特征氧原子位于羧基的P位上(图2)。与此相反，表现出更高活化作用的合成聚合物在羧酸结构部分的(5位上具有碳原子或氢原子(图3)。因此，本发明提供具有经改性的多糖的结合层，所述结合层含有其中卩-原子(即在羧基的P-位上)仅为碳原子或氢原子的羧基。如本文下面所述，这种层(实施例1、图4)既表现出改善的固定效率，也表现出高的配体活性，使得待分析物信号整体上得到显著的提高(实施例2-6)。不希望受理论的束缚，本发明人认为所观察到的这种差别可能源自羧基的(3-原子所导致的极性效应。通常以醚或者羟基的形式而出现在多糖中的氧原子具有诱导吸电子作用，而碳原子一般来说趋于给予电子。因此，卩位为碳的羧基比(3位为氧的羧基原则上具有更多的电子(即具有较弱的酸性)。这种富电性可以使活化过程中的中间体(例如羧基与碳二亚胺反应而形成的O-酰基异脲中间体)保持稳定，并因此改善了活化过程，从而使得配体得到固定。还应当注意的是，当另外一个吸电子基团(例如胺基)位于(3位时(例如通过使用基于羧甲基壳聚糖的结合层)，该羧基的活化程度与(5位为氧的羧基的活化程度相似。正如本领域技术人员已知的那样，a-碳是指连有官能团的碳，在本发明中，oc-碳是指连有羧基结构部分的碳。如上文中所述，本发明的层中包括p位为碳基团或氢的羧基。这种碳基团可以选自烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、链烯基、炔基、芳烷基、杂芳垸基、羧基、垸基氨基羰基、二垸基氨基羰基、芳基垸基氨基羰基、芳基氨基羰基、羟基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、亚垸基(alkylene)、亚氮杂烷基、亚硫杂垸基、亚链烯基、亚炔基、亚环垸基、亚芳基、亚杂芳基、亚烷基(alkylidene)、亚芳垸基、亚环烷基和酰氨基。如果可能的话，所述碳基团中的每个基团可以是取代的或具有支化的。本文所用的垸基、链烯基和炔基碳基团含有1至20个碳原子、或者1或2至16个碳原子，并且这些基班是直链的或具有支链的。碳原子数为2至20的链烯基碳基团含有1至8个双键，碳原子数为2至16的链烯基碳链含有1至5个双键。碳原子数为2至20的炔基碳链含有1至8个三键，碳原子数为2至16的炔基碳链含有1至5个三键。本文中的垸基、链烯基和炔基的例子包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基(丙炔基)。本文中所使用的用于各种基团的各化学术语都具有该术语最广泛的含义。例如，对于所述各基团的特定的定义可以在"ChemicalTerms"S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillBookCo,New-York,1985中找到。在活化过程中使用NHS和硫代NHS，从而形成具有反应活性的酯。仍然不希望受理论的束缚，本发明人认为，经硫代NHS活化后的层的独特性源自在活化时所述层能够保持其大部分的负电荷。因此，预先富集到活化的层上的静电电荷的效率更高，可以获得高水平的固定。当使用具有容易被活化的羧基的层时，这种作用更加突出，因为其活化度高于常规使用的层的活化度(图5)。NHS或硫代NHS试剂可以在在线活化时由系统操作者(使用者)加入到所述层中，或者设置为所述层(预活化的层)的固有部分。已经发现，使用上述方法在许多生物模型中都可以获得高的配体密度和活性，即增强的待分析物信号(实施例4-6)。更具体地说，观察到在活化步骤中使用硫代NHS可以产生特别提高的待分析物信号。将基于具有容易被活化的羧基的多糖的结合层与采用硫代NHS进行活化相结合，在配体密度和活性方面可以获得最佳的结果，因此这种结合代表了本发明的优选实施方案。在本发明的又一方面中，提供在配体固定后使所述层的静电电荷的量达到最小化的方法。使用中性的含胺分子(例如，如图5中所示)或者带正电荷(例如，如图6中所示)的含胺分子，高程度的活化能够在灭活后有效地使电荷的量最小化。为了在灭活前的固定步骤中保持所述层的静电电荷，优选在该应用中也使用硫代NHS。下述实施例描述了使用lab-prototype型的ProteOnXPR36系统(Bio-Rad)形成用于SPR传感器芯片的结合层时的本发明的实施方案以及所述层在生物传感器应用中的用途。然而，应当注意的是，本发明旨在用于本领域已知的结合层或结合基质的任何应用中。其可以在需要将分子固定到固体载体的任意类型的生物检测(例如ELISA)中实施。当本发明用于涉及将分子固定到微球上的纯化方法(例如亲和色谱法)时，本发明的原理也具有优势。实施例1结合层的制备使用丄呵mw/r2001,17,8336-8340中所采用的技术，将CMD、海藻酸、羧甲基纤维素或聚(丙烯酸)薄层附着到ProteOnSPR传感器芯片的金表面上。简单地说，将各聚合物溶解于水溶液中，在EDC和NHS存在下，在使用胱胺二聚物将聚合物的少量的羧基进行改性的条件下，使该聚合物与胱胺二盐酸盐反应。然后通过四(羧乙基膦)还原胱胺的二硫键，并通过透析法纯化该溶液。产物为聚合物的水溶液，其当前含有能够使该聚合物连接到金表面上的硫醇端基。将传感器芯片在含有经胱胺改性的聚合物的水溶液中浸渍24小时。通过改变各种参数，例如胱胺改性的程度、聚合物的浓度、溶液pH和离子强度，来改变所述涂层的结构。因此，在用水冲洗后，形成具有不同的蛋白质吸附容量的各种层(表1)。如下文所述，在各种试验中使用没有进一步进行改性的各类型聚合物的传感器芯片。另外，将含有多糖(CMD、海藻酸和羧甲基纤维素)的传感器芯片用(3-丙氨酸进行改性，从而含有容易被活化的羧基(图4)。将这些传感器芯片在含有1M的(5-丙氨酸乙酯盐酸盐、0.2M的EDC和0.05M的NHS的水溶液中浸渍16小时。将过量的试剂用水洗去，并通过在0.1M的NaOH中浸渍l小时进行水解，除去乙酯保护基团。对所得到的结合层进行表征，并用于如下文所述的各种试验。本发明的实施例中使用的结合层示于表1中。吸附容量由通过将IgG型抗体蛋白静电富集到表面上而获得的特征饱和值来标示。本文中使用的SPR信号的单位为该领域中所认可的响应单位(RU)。一千个RU等同于SPR曲线上的0.1度位移，己知其代表约1ng/mn^的蛋白质结合或吸附到表面上。表l经测试的各种结合层<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2示出了在将兔IgG抗体在相似的条件下吸附或固定到五个结合层上之后的配体密度的例子。活化方法包括将结合层暴露于含有0.2M的EDC和0.05M的NHS或硫代NHS的溶液中(向结合层喷射7分钟)。通过暴露于在10mM乙酸钠缓冲液中形成的50pg/ml的兔IgG的溶液(pH4.5)中，进行蛋白质的吸附/固定(向结合层喷射6分钟)。最后，通过暴露于1M的乙醇胺盐酸盐溶液(pH8.5)(向结合层喷射5分钟)，使被活化的层灭活。表2兔IgG抗体被吸附或固定后的配体密度<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>基于聚(丙烯酸)的层1表现出相对高水平的固定一与用NHS活化后的吸附容量接近，并与用硫代NHS活化后的吸附容量相等。另一方面，未改性的多糖层(层2至层4)表现出较低的固定值，并且用硫代NHS活化与用NHS活化之间仅有微小的差别。最重要的是，使用P-丙氨酸对这些层进行改性(分别为层2E至4E)，在吸附容量没有受到影响的条件下导致结合能力显著增强。用硫代NHS活化后，配体密度特别高，从而实现了吸附容量的全部潜力。这些结果表明将多糖进行改性从而使其含有(3-碳的羧基而不含有卩-氧的羧基，提高了它们在活化后结合蛋白质的能力。NHS活化和硫代NHS活化之间的差别越突出，表明在用(3-丙氨酸进行改性后，形成了容易被活化的羧基，所以活化越有效。实施例3低等电点(PI)蛋白质的偶联效率已知的是，低等电点(PI)的蛋白质难于固定。这种蛋白质应当溶解于具有相对低的pH的缓冲液中，从而使其带有正电荷，进而静电吸附到所述层上。但是在低pH值的条件下，所述层中的羧基本身的负电荷减少，因此静电吸引力减弱。例如，据报道PI为3.0的蛋白质胃蛋白酶在进行标准的EDC/NHS活化后对CMD层只表现出可以忽略不计的结合力(70RU)(Anal.Biochem.1991,198，268-277)。采用基于用(3-丙氨酸改性的海藻酸的结合层(层5E)进行相似试验，其结果列于表2中。这些结果表明在用EDC/NHS活化后具有较大的结合能力(750RU)，在用EDC/硫代NHS活化时具有更大的结合能力(2050RU)。这种优点应当与使用容易被活化的羧基有关，因为层5E的吸附容量远小于报道的CMD层的吸附容量(与CMD层的吸附容量大于30,000RUIgG相比，该层5E的吸附容量为12,000RUIgG)。这个实验证实了，具有容易被活化的羧基的层可以用于那些利用低PI配体进行的检测，所述低PI配体此前不能被充分地固定到常规使用的层上。实施例4抗体-抗原相互作用研究中的配体活性表3概括了使用各种结合层进行的动力学分析的结果。在用EDC/NHS对结合层进行活化后，将条件优化使得能够结合约2,000RU的抗-白细胞介素-2单克隆抗体，在该条件下这种蛋白质被固定。然后，将作为待分析物的浓度为2.5nM至80nM的白细胞介素-2在表面上流动。Rn^是由动力学分析计算得到的最大的待分析物信号。配体的活性定义为(RmJ配体密度)x(配体的分子量/待分析物的分子量)。表3使用各种结合层进行的抗体与抗原之间的动力学分析的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3中所示的结果表明所有的基于多糖的层(这些层都被改性以含有容易被活化的羧基)都保持了接近100%的高配体活性。与此相反，基于合成的聚(丙烯酸)的层的配体活性显著降低。这种差别可能与多糖具有更高的生物相容性有关。实施例5蛋白质-蛋白质的相互作用研究中的分析灵敏度表4概括了(3-内酰胺酶蛋白(TEM1)的突变体与其抑制剂蛋白(BLIP)之间的动力学分析的结果。在所有试验中都使用基于海藻酸的结合层。活化方法包括将该结合层暴露于0.2M的EDC和0.05M的NHS或硫代NHS的溶液中(向结合层喷射7分钟)。通过暴露于在10mM乙酸盐缓冲液中形成的2uM的TEM1的溶液(pH4.0)中(向结合层喷射5分钟)使配体固定。最后，通过暴露于1M的乙醇胺盐酸盐溶液(pH8.5)中(向结合层喷射5分钟)而使被活化的层灭活。向结合层喷射浓度为9nM至300nM的一系列作为待分析物的BLIP。表4(3-内酰胺酶蛋白(TEM1)的突变体与其抑制剂蛋白(BLIP)之间的动力学分析的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>未改性的层由于不能结合足够量的配体，因此待分析物信号对于动力学分析来说太弱。在使用p-丙氨酸进行改性后，配体结合能力显著增强，获得良好的动力学分析结果。使用硫代NHS代替NHS进行活化不仅增加了配体的量，而且增强了配体的活性，产生更清晰的传感图，并且信噪比更高(图6)。因此，具有容易被活化的羧基的改性，使得原先不能进行的分析现在能够进行了。该羧基的改性与硫代NHS活化相结合是最有利的。实施例6蛋白质-小分子相互作用研究中的分析灵敏度表5概括了蛋白质碳酸酐酶II(CAII)与其抑制剂4-羧基苯磺酰胺(CBS，分子量201g/mo1)之间的动力学分析的结果。在所有式样中都使用基于海藻酸的结合层。活化方法包括将该结合层暴露于0.2M的EDC和0.05M的NHS或硫代NHS的溶液中(向结合层喷射7分钟)。通过暴露于在10mM的乙酸盐缓冲液中形成的0.125mg/ml的CAII的溶液(pH5.0)中(向结合层喷射9分钟)使配体固定。最后，通过暴露于1M的乙醇胺盐酸盐溶液(pH8.5)中(向结合层喷射5分钟)而使被活化的层灭活。向结合层喷射浓度为0.082|Limol/L至20pmol/L的一系列作为待分析物的CBS。表5蛋白质碳酸酐酶II(CAII)与4-羧基苯磺酰胺(CBS)之间的动力学分析的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>与实施例5相似，使用P-丙氨酸进行改性所引起的改善很明显。不仅配体密度显著增大，而且配体活性变得更高。即使当使用NHS进行活化时也观察到配体活性增高，但是在用硫代NHS进行活化时配体活性增高得更多。因此，此处通过具有容易被活化的羧基的改性再次显著地提高了分析灵敏度。这个例子具有特殊的意义，因为以更高的灵敏度来测定蛋白质-小分子的相互作用是生物传感器领域中的"圣杯"之一。这种分析灵敏度的提高在应用上的重要性(例如)在用于药物发现的分析中是很明显的。实施例7电荷最小化将两个基于海藻酸的结合层进行相似的试验以进行比较，其中一个结合层使用卩-丙氨酸进行改性，而另一个结合层未使用(3-丙氨酸进行改性。在图7中示意性地描述了改性的方法，结果概括于下面的表6中。通过暴露于0.2M的EDC和0.05M的NHS或硫代NHS的溶液中(向结合层喷射7分钟)，使传感器芯片活化，然后立即通过暴露于lM的二甲基乙二胺溶液(pH8.5)中(向结合层喷射5分钟)而使其灭活。采用该方法预计使所述层的负电荷减少或者甚至完全消除，因为一部分的羧基转化为带正电荷的叔胺。更有效地进行活化将会更有效地使电荷最小化。通过测定带正电荷的蛋白质亲和素(PI=10.5)在所述层上的吸附量，对比性地估计负电荷的量。将溶于10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的亲和素(50ug/ml)向结合层喷射7分钟。该试验分别在使电荷最小化之前和之后进行。表6海藻酸层的电荷最小化<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表6中所示的结果提供了关于用P-丙氨酸进行改性后的结果的明确说明。使电荷最小化的方法虽然对未改性的层仅有很小的作用，但是使经改性的层中的负电荷全部消除。由此可以推断，经改性的层可以被更有效地活化，因此有更多的羧基与二胺分子发生反应。此外，在pH为7.4的条件下，羧基基本上带有负电荷，而叔胺基本上带有正电荷，这意味着至少50%的容易被活化的羧基被EDC/NHS或EDC/硫代NHS溶液活化。与此有别，据报道在类似的条件下，在CMD层中只有30%-40%的羧基被活化(Anal.Biochem.1991,198,268-277)。本发明的所述层的这种特征具有应用上的重要性。如上所示，使电荷最小化的过程可以是使配体固定的过程中的一部分，其中在活化后并在灭活前使配体结合。可选择的是，该过程可以在常规的配体固定过程之前或之后进行。无论是哪种情况，其结果都是在配体结合到层上之后所述层不带有负电荷。如上所述，在待分析物相互作用的阶段不带有静电电荷的层对于防止非特异性结合以及其它的电荷干扰来说是有利的，特别是当使用带有大量电荷的待分析物时所述层是有利的。因此，该实施例不仅表示所提供的层的特征的含义，而且表示一种在配体结合前、配体结合过程中或配体结合后有效地使所述层的电荷最小化的方法。所用的灭活剂二胺仅仅是作为举出的例子，也可以使用类似的分子，例如乙二胺和肼。结果表明在这种情况中NHS活化和硫代NHS活化之间没有差别。但是，基于上面所述的其它结果，很明显的是，如果在活化过程和灭活过程之间进行配体的结合，为了获得更有效的偶联，优选用硫代NHS进行活化。权利要求1.一种结合层，其包含被至少一个羧基或其衍生物取代的多糖，其中所述羧基或其衍生物的每个β-原子都是氢原子或碳原子，并且其中多个所述羧基或其衍生物中的至少一部分被活化，用于与配体分子结合。2.根据权利要求1所述的结合层，其中所述多糖选自琼脂糖、海藻酸、支链淀粉、直链淀粉、鹿角菜胶、纤维素、甲壳素、壳聚糖、葡聚糖、糖原、类肝素、肝素、透明质酸、果胶、淀粉或它们的任意衍生物。3.根据权利要求1或2所述的结合层，其中所述多糖选自海藻酸、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、果胶或它们的任意衍生物。4.根据前述权利要求中任意一项所述的结合层，其中所述配体分子选自核酸、肽、蛋白质、多肽、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、聚糖、小的有机分子、细胞、病毒、细菌和生物样品。5.根据前述权利要求中任意一项所述的结合层，其中所述至少一个羧基与含有1至20个碳原子的连接分子键合。6.根据权利要求5所述的结合层，其中所述连接分子含有2个或3个碳原子。7.根据前述权利要求中任意一项所述的结合层，其中所述至少一种衍生物选自羧酸酯、酰胺、酸酐、酰卤和醛。8.权利要求7所述的结合层，其中所述衍生物为酯。9.权利要求8所述的结合层，其中所述酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯或其衍生物。10.权利要求9所述的结合层，其中所述衍生物为N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯。11.根据权利要求1所述的结合层，其包含羧基与其衍生物的混合物。12.权利要求11所述的结合层，其中所述衍生物选自羧酸酯、酰胺、酸酐、酰卤和醛。13.根据前述权利要求中任意一项所述的结合层，其中所述多糖被固定在具有表面的固体基底上。14.根据权利要求13所述的结合层，其中所述基底为生物传感器的传感元件。15.根据权利要求14所述的结合层，其中所述传感元件由选自玻璃、塑料和具有自由电子的金属中的材料构成。16.根据权利要求15所述的结合层，其中所述具有自由电子的金属为金。17.根据权利要求1所述的结合层，其中所述羧基基本上被全部活化。18.根据权利要求1所述的结合层，其中至少50%的所述羧基被活化。19.一种制备包含至少一个羧基或其衍生物的结合层的方法，其中所述至少一个羧基或其衍生物的每个卩-原子都是氢原子或碳原子，该方法包括下述步骤提供具有表面的基底；将多糖固定在所述基底的表面上；将所述多糖进行化学改性，从而形成从所述多糖中伸展出来的至少一个羧基或其衍生物，其中所述羧基或其衍生物的每个(3-原子都是氢原子或碳原子；以及对所述羧基或其衍生物中的至少一部分进行活化，用于与配体分子连接，其中所述化学改性步骤和所述活化步骤彼此独立，并可以在所述固定步骤之前、所述固定步骤进行过程中或者在所述固定步骤之后发生。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述化学改性步骤包括使至少一个具有卩-氧原子的羧基或其衍生物进行化学反应。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述化学反应是采用(3-丙氨酸或其任意的衍生物进行的酰胺化。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述多糖选自海藻酸、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、果胶或它们的任意衍生物。23.根据权利要求19至22中任意一项所述的方法，其中至少50%的所述羧基或其衍生物被活化从而形成N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯。24.根据权利要求19至23中任意一项所述的方法，其中所述多个被活化的羧基或其衍生物与配体分子发生反应，从而使所述配体分子通过共价键结合到所述层上。25.—种对配体和待分析物分子之间的相互作用进行分析的分析方法，该方法包括下述步骤根据权利要求19至23中任意一项所述的方法制备结合层；将至少一个能够与至少一个待分析物分子发生相互作用的配体分子结合到所述层上；使所述配体分子与所述待分析物分子反应，从而使它们之间产生相互作用；以及分析所述的相互作用。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述配体分子和所述待分析物分子独立地选自核酸、肽、多肽、蛋白质、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、小的有机分子、细胞、病毒、细菌和生物样品。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分析基于荧光法、核学法、磁学法、电化学法或光学法。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述分析基于光学法。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述光学法为表面等离子体共振法。全文摘要本发明提供一种结合层，其包含被羧基或其衍生物取代的多糖，该结合层在与配体分子结合方面以及在与待分析物分子相互作用方面表现出高的性能。本发明也提供制备所述结合层的方法以及检测各种待分析物分子的方法。文档编号G01N33/543GK101341409SQ200680047752公开日2009年1月7日申请日期2006年6月21日优先权日2005年10月27日发明者沙伊·尼迈里申请人:生物辐射海法有限公司