专利名称：一种stlv双抗原夹心酶联免疫吸附测定法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体底是涉及一种改良的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附 (ELISA)测定法及其试剂盒。
技术背景猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(Simian T-lymphotropic virus type 1， STLV-l)是猴群中 一种重要的传染性病毒，该病毒主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊 乱，从而影响动物实验的研究。早在1992年，中华人民共和国卫生部颁布的《医学实验动物 标准》规定STLV-1型是SPF实验猴必须排除的病毒之一。随着当前国际市场对SPF实验猴需求 量的增加，STLV-l病毒已被列为必须排除的病原之一。酶联免疫吸附实验(ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术后发展的一种酶免技术，涉及 到医学、生物学、遗传学、免疫等许多科学，其基本原理是利用抗原、抗体的特异性反应， 用已知抗原或抗体检测未知抗原或抗体，由于ELISA试验方法具有敏感、特异、经济、简便、 安全等特点，在疾病的诊断和疗效观察以及预防医学方面应用尤为广泛。目前使用的STLV双抗原夹心方法用于测定抗体，基本操作步骤如下 1、抗原包被将特异性抗原包被固相载体，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质；2、 加入待检测的血清或血浆标本，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相 抗原抗体复合物，洗涤除去未结合抗体和杂质；3、 加入酶标的已知抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物，洗涤除去 未结合酶标抗原。4、 加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗体的量。上述ELISA方法中，由于步骤较多，经常会发生酶标抗原和标本漏加或错加的现象，标 本污染酶标抗原的现象，以及溶液状态保存的酶标抗原会由于运输和放置过程中产生的各种 原因导致免疫活性下降，进而影响检测结果的准确性，因此，本发明旨在建立一种方便可行 的双抗原夹心快速检测方法，提高检测灵敏度，加快检测速度，降低加样过程中的污染问题， 节省人力、物力，降低检测成本。发明内容本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，该测定法可减少双抗原夹心方法中的加样步骤，减少加样污染，且更为快速、灵敏的检 测方法。解决的技术问题的技术内容如下一种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，包括以下步骤A. 制备酶联板1) 、抗原包被将6ng/mL的(90—110yL) STLV特异性抗原包被聚氯乙烯板或聚苯乙烯板 中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质，4'C阴干，得到包被板；2) 、包被板封闭(110—130 iiL)封闭液于4。C加到包被板的微孔中，封闭10—14h,甩干后 阴干；3) 、加入(45 — 55uL)酶标的已知STLV抗原(6ng/mL)，放在真空冷冻干燥箱中干燥l-3h， 使之附着在固相抗原表面，得到制备好的酶联板；B. 检测步骤4) 、加入40 —60u L被待检测的血清或血浆标本以及(40—60yL)标本稀释液，使标本中的 抗体与固相载体上的抗原复合物充分反应，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去 未结合抗体和杂质；5) 、加底物显色加入显色底物(頂B)，固相上的酶催化底物产生有色产物，通过比色，测标 本中抗体的量。本发明中，酶联板为聚氯乙烯板或聚苯乙烯板，优选聚苯乙烯板。本发明中，封闭液为(O. lmol/1) PBS溶液，内含1% BSA (牛血清白蛋白)、4%蔗糖，5 %。蛋白胨，有效屏蔽未包被的空间，减少非特异性反应。本发明中，标本稀释液为(0.015mol/L)三羟甲基氨基甲烷溶液，内含2%蔗糖，1%。吐 温-20， 1%。硫柳汞，10%小牛血清，减少非特异性反应。本发明中，所述小牛血清的是灭活或不灭活的无菌小牛血清。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附试剂盒。具体方案如下一种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附试剂盒，其特征是包括有酶联板，该酶联板为包 被有固相STLV特异性抗原-酶标STLV抗原复合物的聚氯乙烯板或聚苯乙烯板；该酶联板的制 备方法为1)、抗原包被将浓度为6 Pg/mL的STLV特异性抗原90—110 ixL包被聚氯乙烯 板或聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质，4'C阴干，得到 包被板；2) 、包被板封闭将110-130 iiL封闭液4i:加到包被板的微孔中，封闭10—14 h,甩干后阴 干；3) 、每孔微孔中加入浓度为8X102 ug/mL酶标的STLV抗原45 — 55yL，放在真空冷冻干燥箱 中干燥，使之附着在固相抗原表面，得到制备好的酶联板。本发明中，所述的酶联板中加入了特异性抗原和特异性酶标抗原。避免在检测过程中添 加酶标抗原，减少双抗原夹心方法中的加样步骤，减少加样污染；其二，酶标抗原以一种固 化的方式，降低了运输或保存过程中活性的降低。本方法不仅对医学微生物病原诊断有价值， 而且对流行病学调查、筛选、临床诊断有重要意义。经过改良的双抗原夹心酶联免疫吸附ELISA 测定法及其试剂盒具有检测速度快，节省人力、物力、降低检测成本等优点。符合快速、简 单、明了的方法，易于推广，能满足基础需要，并适合流行病学调査。
具体实施方式
以下实施例中，所用试剂为封闭液(0. lmo1/1) PBS溶液(Na,C03-NaHC03缓冲液)，内含1% BSA (牛血清白蛋白)、 4%蔗糖，5%。蛋白胨。标本稀释液(0.015mol/L)三羟甲基氨基甲垸溶液，内含2%蔗糖，1%。吐温-20, 1%0硫 柳汞，10%小牛血清。本实施例中，STLV特异性抗原和酶标抗原来自北京养生堂生物技术有限公司。实施例1STLV双抗原夹心酶联免疫吸附ELISA测定法，包括下列步骤 (一)制备酶联板1、 抗原包被将浓度为6 w g/mL的STLV特异性抗原100 n L (可用0. lmol/1 PBS溶液作 为抗原稀释液)包被固相载体，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质，4'C阴干；2、 包被板封闭(120 !iL)封闭液4r放置12 h，甩干后阴干；3、 加入浓度为8X10—2 Pg/mL (50 uL)酶标的STLV抗原，放在真空冷冻干燥箱中干燥2h， 使之附着在固相抗原表面；取出后放室温平衡lh，得到制备好的酶联板。检测步骤
1、 加入50 yL实验猴的血清或血浆标本以及50 uL稀释液，使标本中的抗体与固相载体上 的抗原复合物充分反应，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合抗体和杂质;
2、 加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色，测标本中抗体的量。 灵敏度和特异性检测结果血清样品阳性结果/测试样品敏感度S柳plePositive/testedSensitivitySTLV90/90100%血清样品阴性结果/测试样品特异性SampleNegative/testedSpecificityBV infectors8/8100%SIV infectors8/988. 9%Healthy donors82/8398. 7%(98/100)98. 0%
权利要求
1.一种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，其特征是包括以下步骤A.制备酶联板1)、抗原包被将浓度为6μg/mL的STLV特异性抗原90-110μL包被聚氯乙烯板或聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质，4℃阴干，得到包被板；2)、包被板封闭将110-130μL封闭液于4℃加到包被板的微孔中，封闭10-14h，甩干后阴干；3)、每孔微孔中加入浓度为8×10-2μg/mL酶标STLV抗原45-55μL，放在真空冷冻干燥箱中干燥，使酶标STLV抗原附着在固相抗原表面，得到制备好的酶联板；B.检测步骤4)、加入40-60μL待检测的血清或血浆标本以及40-60μL标本稀释液，37℃温育1-2h，使标本中的抗体与固相载体上的抗原复合物充分反应，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合抗体和杂质；5)、加底物显色加入显色底物，固相上的酶催化底物产生有色产物，通过比色，测标本中抗体的量。
2. 根据权利要求1所述的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，其特征是所述封闭液为 0. lmo1/1的PBS溶液，该溶液中还含有1% BSA、 4%蔗糖，5%。蛋白胨。
3. 根据权利要求1所述的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，其特征是所述标本稀释液 为0.015mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液，该溶液中还含有2%蔗糖，1%。吐温-20， 1%。硫柳汞， 10%小牛血清。
4. 根据权利要求1所述的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法，其特征是步骤l)中包 被抗原的量为50uL;步骤3)中加入酶标的STLV抗原的量为50nL。
5. —种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附试剂盒，其特征是包括有酶联板，该酶联板为包被有 固相STLV特异性抗原-酶标STLV抗原复合物的聚氯乙烯板或聚苯乙烯板；该酶联板的制备方 法为1)、抗原包被将浓度为6 y g/mL的STLV特异性抗原90 — 110 u L包被聚氯乙烯板或 聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未结合的抗原及杂质，4'C阴干，得到包被 板；2) 、包被板封闭将110-130 yL封闭液4'C加到包被板的微孔中，封闭10—14 h，甩干后阴 干；3) 、每孔微孔中加入浓度为8X10—2 W g/mL酶标的STLV抗原45 — 55 uL，放在真空冷冻干燥箱 中干燥，使之附着在固相抗原表面，得到制备好的酶联板。
6.根据权利要求5所述STLV双抗原夹心酶联免疫吸附试剂盒，其特征是步骤1 )中包被STLV 特异性抗原的量为50iiL;步骤3)中加入酶标的STLV抗原的量为50"L。
全文摘要
本发明公开了一种STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法及其试剂盒，该测定法包括以下步骤1)STLV抗原包被；2)包被板封闭；3)加入酶标的STLV抗原；4)加入被检标本以及标本稀释液，使标本中的抗体与固相载体上的抗原复合物充分反应，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合抗体和杂质；5)加底物显色，通过比色，测标本中抗体的量。经过改良的STLV双抗原夹心酶联免疫吸附测定法及其试剂盒具有检测速度快，节省人力、物力、降低检测成本等优点。符合快速、简单、明了的方法，易于推广，能满足基础需要，并适合流行病学调查。
文档编号G01N33/569GK101246167SQ200810026820
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月17日 优先权日2008年3月17日
发明者万玉玲, 刘晓明, 芳 季, 饶军华 申请人:广东省昆虫研究所